VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2.Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 1 Trang thiết bị và dụng cụ
3.3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
-Hệ thống Real - time PCR của Bio - Rad (Hình 2.8) -Tủ cấy vô trùng
-Tủ lạnh lưu mẫu -Máy khuấy từ
-Máy nhiệt khô (hoặc bể điều nhiệt) -Máy ly tâm
-Vortex mixer (máy trộn mẫu)
-Các loại eppendorf 0,2; 0,5; 1,5 ml
-Micropipette với các loại thể tích từ 0,5 µl đến 1000 µl -Cân phân tích
-Bếp điện
-Kéo, đèn cồn và panh
-Bộ điện di nằm ngang và bộ nguồn
-Máy đọc kết quả điện di GelDoc iQ của Bio - Rad -Máy iCycler của Bio - Rad
Hình 3.3 Máy iCycler
3.3.2.2. Hoá chất
Bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm” của công ty Nam Khoa do Bio - Rad tài trợ.
Các thành phần của bộ kit gồm có:
- Bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm gồm có các thành phần để pha dung dịch tách chiết: nước cất (50 ml), NaOH (350 µl), SDS (150 µl), ống eppendorf 1,5 ml: 50 ống, chày nhựa (dụng cụ nghiền mẫu dùng cho ống eppendorf): 10 cái/ gói x 5 gói
- 50 ống eppendorf, mỗi ống có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR gồm các thành phần: primer, dNTP, Taq polymerase, TaqMan probe, Mg2+, dung dịch đệm PCR.
- Đối chứng âm (control (-)): 100 µl dung dịch TE 1X - Đối chứng dương (control (+)): 100 µl ADN của WSSV
- 5 chuẩn (standard (std)): 50 µl mỗi chuẩn có chứa ADN của WSSV với hàm lượng lần lượt là: 105 bản sao/ 2 µl, 104
bản sao/ 2 µl, 103 bản sao/ 2 µl, 102 bản sao/ 2 µl, 101 bản sao/ 2 µl.
Bộ kit “Nested PCR phát hiện WSSV trên tôm” gồm có:
- Bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm với các thành phần tương tự như bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm đi kèm trong bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm”
- 50 ống eppendorf, mỗi ống có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR, Taq polymerase, dNTP, primer, Mg2+, UNG và dUTP.
- Đối chứng âm (control (-)): 100 µl dung dịch TE 1X - Đối chứng dương (control (+)): 100 µl ADN của WSSV
- Hóa chất dùng cho điện di: bộ thuốc thử điện di do công ty Nam Khoa sản xuất từ các hoá chất của Bio - Rad, Merck và Sigma gồm có dung dịch TBE 10X (Tris - Boric acid - EDTA), agarose, dung dịch nạp mẫu 5X (bromophenol blue và glycerol), dung dịch ethidium bromide (10 mg/ ml), thang ADN chuẩn 100 – 1000 bp có khoảng cách 100 bp của Bio - Rad.
Bộ ly trích Instagene Matrix của công ty Bio – Rad: gồm có 20 ml dung dịch Instagene Matrix có các hạt nhỏ lơ lửng tích điện âm và các protein kinase. Các hạt nhỏ này sẽ gắn kết với ion hóa trị hai (các ion này hỗ trợ enzyme phân giải ADN mẫu) trong dịch tách chiết ADN, nhờ đó các ion hóa trị hai được loại bỏ. Các protein kinase có tác dụng biến tính các thành phần protein trong phần dịch nổi sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt.