Con tằm sau khi khử trùng đƣợc đặt lên giấy thấm vô trùng trong hộp nhựa và dùng xi lanh phun dịch nấm lên từng thân con tằm với các thể tích dung dịch giống nấm khác nhau, nhƣ sau:
- Phun 100 µl dịch giống - Phun 200 µl dịch giống - Phun 300 µl dịch giống - Phun 400 µl dịch giống - Phun 500 µl dịch giống - Phun 600 µl dịch giống
Sau khi thực hiện phun dịch nấm vào tằm dâu, mẫu đƣợc nuôi trong điều kiện phòng tối, nhiệt độ 22oC và độ ẩm 60%. Sau 10 ngày nuôi tối, đánh giá tỷ lệ mẫu nhiễm nấm, tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan hoàn toàn cơ thể.
Hình 2.2: Lây nhiễm nấm vào tằm bằng phƣơng ph p phun dịch giống nấm lên thân con tằm.
2.4.2. Nghiên cứu thời gian nuôi tối phù hợp cho phát triển hệ sợi trong con tằm con tằm
Con tằm sau khi khử trùng đƣợc tiêm vào phần đầu với thể tích dung dịch giống nấm phù hợp thu đƣợc sau kết quả nghiên cứu ở mục 2.4.1. Tằm sau khi tiêm đƣợc đặt vào lọ/hộp có sẵn ống nhựa đen bằng kích thƣớc con
tằm và đƣợc nuôi trong phòng tối, ở điều kiện nhiệt độ phòng 22OC, độ ẩm 60% sau 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ngày đƣợc đƣa ra nuôi sáng dƣới cƣờng độ ánh sáng giàn đ n Led trắng 700 lux, thời gian chiếu sáng 12 h/ngày, nhiệt độ 22OC, độ ẩm 85%. Sau 20 ngày chiếu sáng tiến hành thu thập số liệu và đánh giá tỷ lệ tằm bật mầm quả thể nấm, hình thái mầm quả thể.
2.4.3. Nghiên cứu điều kiện nuôi trồng phát triển quả thể nấm trên con tằm
Từ kết quả thí nghiệm ở mục 2.4.1 và 2.4.2, tiến hành thí nghiệm xác định điều kiện độ ẩm, nhiệt độ, ánh sáng phòng nuôi.
Tiêm 150 – 200 µl dung dịch giống nấm vào phần đầu tằm, sau đó đặt vào ống nhựa đen (30 ống/lọ 700 ml hoặc 50 ống/hộp nhựa 500 ml), nuôi trong phòng tối ở nhiệt độ phòng 22OC, độ ẩm 60% sau 12 ngày khi hệ sợi phát triển ăn lan toàn bộ cơ thể con tằm đƣợc chuyển ra nuôi sáng với các điều kiện độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng khác nhau. Sau 40 ngày nuôi trồng tiến hành thu thập số liệu, phân tích và đánh giá tỷ lệ bật mầm quả thể, số lƣợng quả thể, chiều dài quả thể.
Thí nghiệm 1: Khảo sát độ ẩm phòng nuôi đến phát triển quả thể nấm ở độ ẩm 80%, 85%, 90% và 95%; nhiệt độ và ánh sáng đặt cố định: nhiệt độ phòng nuôi 22OC, cƣờng độ ánh sáng đ n Led trắng 700 lux, thời gian chiếu sáng 12 h/ngày.
Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ phòng nuôi đến phát triển quả thể nấm ở các nhiệt độ 18O
C, 20OC, 22OC và 25OC; độ ẩm và ánh sáng đặt cố định: độ ẩm 85%, cƣờng độ ánh sáng đ n Led trắng 700 lux, thời gian chiếu sáng 12 h/ngày.
Thí nghiệm 3: Khảo sát cƣờng độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến phát triển quả thể nấm ở dải cƣờng độ ánh sáng 700 lux, 1400 lux, 2100 lux, 2800 lux và thời gian chiếu sáng 12 h/ngày, 14 h/ngày và 16 h/ngày; độ ẩm và nhiệt độ phòng nuôi trồng đặt cố định: độ ẩm 85%, nhiệt độ 22OC.
2.4.4. Nghiên cứu phương thức nuôi cấy thích hợp
Sau khi xác đinh đƣợc các điều kiện nuôi cấy tối ƣu ở mục 2.4.3, tiến hành thí nghiệm xác định phƣơng thức nuôi cấy.
Tằm sau khi lây nhiễm bằng phƣơng pháp tiêm (150 – 200 µl dịch nấm) đƣợc đặt trong ống nhựa đen đƣợc chuẩn bị sẵn trong lọ thủy tinh (30 con/lọ) hoặc hộp nhựa (50 con/hộp) và đặt nằm ngang trên giấy thấm vô trùng đƣợc chuẩn bị sẵn trong hộp nhựa (20 con/hộp); và tằm sau khi khử trùng đƣợc đặt trên giấy thấm vô trùng đƣợc chuẩn bị sẵn trong hộp nhựa, phun 500 µl dung dịch giống nấm trên bề mặt mỗi con.
Các mẫu tằm sau khi lây nhiễm bằng phƣơng pháp tiêm và phun bề mặt đƣợc nuôi trong điều kiện phòng tối, nhiệt độ phòng 22OC, độ ẩm 60%, sau 12 ngày nuôi đƣợc chuyển ra nuôi sáng với cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày; độ ẩm 85% và nhiệt độ phòng nuôi 22OC. Sau 40 ngày nuôi tiến hành thu thập số liệu, phân tích, đánh giá tỷ lệ bật mầm quả thể, số lƣợng quả thể, kích thƣớc quả thể nấm trên con tằm.
2.4.5. Phân tích hàm lượng hoạt chất Adenosine và Cordycepin trong nấm Đông trùng hạ thảo trên ký chủ tằm
Nấm sau 42 ngày nuôi trồng và 52 ngày nuôi trồng đƣợc thu hoạch, sấy khô bằng phƣơng pháp thăng hoa và gửi mẫu đi phân tích hàm lƣợng Adenosine và Cordycepin trong nấm Đông trùng hạ thảo trên ký chủ tằm bằng HPLC tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia.
2.4.6. Phương pháp phân tích số liệu
Tất cả các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần với số mẫu thí nghiệm mỗi lần > 30. Số liệu đƣợc thu thập và phân tích bằng phần mềm Excel.
Các công thức tính:
-Tỷ lệ tằm nhiễm nấm = Số lƣợng tằm nhiễm nấm/tổng số tằm thí nghiệm * 100%
-Tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan 100% Số lƣợng tằm có hệ sơi ăn lan 100%/tổng số tằm thì nghiệm * 100%
-Tỷ lệ tằm bật mầm quả thể = Số lƣợng tằm bật quả thể/tổng số tằm thí nghiệm * 100%
-Số quả thể trung bình/con = Tổng số quả thể/tổng số tằm thí nghiệm -Chiều dài quả thể trung bình/con = Tổng chiều dài của tổng số quả thể/tổng số tằm phát triển có quả thể.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả gây nhiễm nấm vào con tằm
3.1.1. Gây nhiễm bằng phương pháp tiêm
Sau 10 ngày gây nhiễm bằng phƣơng pháp tiêm vào phần đầu con tằm hấp vô trùng với các thể tích dịch giống nấm khác nhau. Số liệu thu đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.1 và hình 3.1. Kết quả cho thấy, với các thể tích dung dịch giống nấm gây nhiễm khác nhau (50 – 300 µl) đều cho tỷ lệ tằm nhiễm nấm 100% nhƣng tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan 100% toàn bộ trên cơ thể sau 8 ngày nuôi tối, ở nhiệt độ phòng nuôi 22OC, độ ẩm 60% rất khác nhau. Ở các công thức tiêm 150 µl và 200 µl dung dịch giống nấm cho tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan 100% toàn bộ trên cơ thể là 100%, ngƣợc lại ở các công thức tiêm thể tích dung dịch giống ít hơn hoặc nhiều hơn lại cho tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan 100% toàn bộ trên cơ thể thấp hơn (41,7 – 84,6%).
Ở công thức tiêm 50 µl dung dịch giống nấm thu đƣợc kết quả tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan 100% toàn bộ trên cơ thể thấp nhất 41,7%; mặc dù 100% tằm có bị nhiễm nấm, tuy nhiên hệ sợi nấm mới chỉ ăn lan ½ đến 2/3 thân con. Ở các công thức tiêm 250 µl dung dịch giống nấm thì tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan 100% toàn bộ trên cơ thể đạt 84,6% và khi tiêm tăng lên 300 µl dung dịch giống nấm thì tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan 100% toàn bộ trên cơ thể giảm rõ rệt xuống còn 63,2%. Nguyên nhân này có thể giải thích, khi tiêm một lƣợng thể tích dung dịch giống nấm lớn kết hợp với lƣợng nƣớc chứa sẵn trong con tằm hấp vô trùng dẫn đến thân con tằm bị mọng nƣớc nên hệ sợi mọc chậm hơn, nhiều con tằm phần đuôi bị mềm nhũn, hệ sợi nấm không phát triển đƣợc.
Từ kết quả thu đƣợc cho thấy thể tích dung dịch giống nấm tiêm phù hợp vào phần đầu con tằm hấp vô trùng là từ 150 đến 200 µl. Trong khi đó, nghiên cứu nuôi trồng nấm C. militaris trên ký chủ nhộng tằm sống cho thấy
khi tiêm thể tích dung dịch giống từ 50 – 75 µl cho tỉ lệ nhộng nhiễm thành công 100% (Hong et al., 2010).
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm và ăn lan hệ s i trên con tằm bằng phƣơng ph p tiêm.
Thể tích dung dịch nấm gây nhiễm (µl) Số tằm thí nghiệm (con) Tỷ lệ tằm nhiễm nấm (%) Số lƣ ng tằm có hệ s i ăn lan 100% Tỷ lệ (%) 50 300 100 125 41,7 100 280 100 230 82,1 150 322 100 322 100,0 200 275 100 275 100,0 250 350 100 296 84,6 300 250 100 158 63,2
Hình 3.1. Con tằm bị nhiễm với 150 µl dung dịch giống nấm sau 10 ngày gây nhiễm, nuôi tối, nhiệt độ phòng nuôi 22OC, độ ẩm 60%. A: Con tằm sau gây
nhiễm đặt đứng trong ống nhựa đen; B: Con tằm sau gây nhiễm đặt nằm ngang trên giấy thấm vô trùng.
B A
3.1.2. Gây nhiễm bằng phương pháp phun bề mặt
Con tằm sau khi khử trùng đƣợc gây nhiễm nấm bằng phƣơng pháp phun trên bề mặt với các thể tích dung dịch nấm khác nhau từ 100 - 600 µl. Sau 10 ngày nuôi tối, ở nhiệt độ phòng nuôi 22OC, độ ẩm 60%, số liệu thu đƣợc tổng hợp nhƣ trình bày ở bảng 3.2. Kết quả thu đƣợc cho thấy phun trên bề mặt con tằm với các thể tích dung dịch nấm khác nhau đều cho tỷ lệ tằm nhiễm nấm 100% nhƣng tỷ lệ tằm có hệ sợi ăn lan 100% cơ thể khác nhau, dao động từ 35,4 – 100% và hệ sợi nấm phát triển trên bền mặt dày, mỏng khác nhau.
Ở công thức phun 100 µl và 200 µl dịch nấm cho tỷ lệ tằm có hệ sợi nấm ăn lan toàn bộ bề mặt cơ thể thấp, tƣơng ứng 35,4% và 60,8% và con tằm có hệ sợi phát triển bề mặt mỏng. Ở các công thức phun 500 – 600 µl dịch nấm cho tỷ lệ tằm có hệ sợi nấm ăn lan toàn bộ bề mặt cơ thể là 100%, hệ sợi phát triển mạnh.
Từ các kết quả khảo sát khi chiếu sáng kích bật mầm quả thể, cho thấy chỉ những con tằm khi có hệ sợi nấm phát triển mạnh, ăn lan toàn bộ cơ thể mới bật mầm và phát triển quả thể. Bởi vậy, khi gây nhiễm nấm trên ký chủ tằm nguyên con bằng phƣơng pháp phun bề mặt thì thể tích dung dịch nấm giống phun từ 500 – 600 µl là đạt hiệu quả nhất.
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm và ăn lan hệ s i trên con tằm bằng phƣơng ph p phun bề mặt
Thể tích dung dịch nấm gây nhiễm (µl) Số tằm thí nghiệm (con) Tỷ lệ tằm nhiễm nấm (%) Số lƣ ng tằm có hệ s i ăn lan 100% Tỷ lệ (%) Ghi chú 100 240 100 85 35,4 Hệ sợi ăn làn bề mặt mỏng 200 240 100 146 60,8 Hệ sợi ăn làn bề mặt mỏng 300 240 100 205 85,4 Hệ sợi ăn làn bề mặt mỏng 400 240 100 220 91,7 Hệ sợi ăn làn bề mặt dày 500 240 100 240 100,0 Hệ sợi ăn làn bề mặt dày 600 240 100 240 100,0 Hệ sợi ăn làn bề mặt dày
Hình 3.2. Con tằm bị nhiễm với thể tích dung dịch giống nấm khác nhau sau 10 ngày gây nhiễm, nuôi tối, nhiệt độ phòng nuôi 22OC, độ ẩm 60%.
3.2. Ảnh hƣởng thời gian nuôi tối đến ph t triển mầm quả thể nấm
Con tằm sau khi khử trùng đƣợc tiêm vào phần đầu với dung dịch giống nấm từ 150 – 200 µl sau đó đặt vào lọ/hộp có sẵn ống nhựa đen bằng kích thƣớc con tằm và đƣợc nuôi trong phòng tối, ở điều kiện nhiệt độ phòng 22OC, độ ẩm 60% sau đó đƣa ra nuôi sáng dƣới cƣờng độ ánh sáng giàn đ n Led 700 lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày, nhiệt độ 22OC, độ ẩm 85%. Sau
300µl
100µl 200µl
400µl
20 ngày chiếu sáng, mầm quả thể hình thành trên phần đầu tằm; thống kê và xử sử số liệu, kết quả thu đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.3. Kết quả cho thấy thời gian nuôi tối khác nhau ảnh hƣởng rõ rệt đến tỷ lệ tằm bật mầm quả thể và hình thức mầm quả thể khi nuôi sáng.
Khoảng thời gian nuôi tối từ 5 – 6 ngày, sau đó chuyển sang nuôi sáng thì 100% tằm không bật quả thể, hệ sợi nấm bị chết dần và con tằm có màu vàng đen. Ở khoảng thời gian nuôi tối 7 và 8 ngày sau đó chuyển nuôi sáng cho tỷ lệ tằm nảy mầm quả thể rất thấp chỉ 5,2% và 8,7%; khi tăng thời gian nuôi tối lên 9 và 10 ngày sau đó nuôi sáng cho tỷ lệ tằm này mầm quả thể tăng lên 48,8% và 79,2% tƣơng ứng nhƣng hình thức mầm quả thể mảnh và nhỏ. Ở công thức thời gian nuôi tối 11 ngày và 12 ngày cho tỷ lệ tằm bật quả thể cao nhất 99,2% và 98,6% tƣơng ứng, mầm quả thể to và đầu nhọn. Khi tăng thời gian nuôi tối lên từ 13 – 15 ngày thì tỷ lệ tằm bật quả thể giảm mạnh.
Kết quả thu đƣợc có thể giải thích nguyên nhân nhƣ sau: khi thời gian nuôi tối ngắn, hệ sợi chƣa ăn lan hết cơ thể con tằm nên hệ sợi phát triển chƣa mạnh khi mang ra chiếu sáng sớm hệ sợi màu trắng chuyển sang màu vàng cam và ngừng phát triển nên không bật đƣợc mầm quả thể. Khi tăng thời gian nuôi tối quá dài thì hệ sợi nấm lại phát triển quá mạnh, bao phủ một lớp hệ sợi nấm trắng trên phần đầu tằm, ảnh hƣởng đến việc bật mầm quả thể. Từ kết quả nghiên cứu thu đƣợc, cho thấy thời gian nuôi tối thích hợp nhất là từ 11 – 12 ngày khi nuôi trồng trên ký chủ tằm nguyên con.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm quả thể nấm. Thời gian nuôi tối (ngày) Số tằm thí nghiệm (con) Số con tằm bật mầm quả thể Tỷ lệ (%) Hình thái mầm quả thể 5 250 0 0,0 - 6 285 0 0,0 - 7 290 15 5,2 Mảnh, nhỏ 8 275 24 8,7 Mảnh, nhỏ 9 250 122 48,8 Mảnh, nhỏ 10 250 198 79,2 Mảnh, nhỏ 11 245 243 99,2 To, đầu nhọn 12 282 278 98,6 To, đầu nhọn 13 245 201 82,0 To, đầu nhọn 14 250 185 74,0 Rất to, đầu tù 15 230 148 64,3 Rất to, đầu tù
Hình 3.3. Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 5 ngày và chuyển sang nuôi sáng. A: nuôi tối 5 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày.
Hình 3.4. Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 9 ngày và chuyển sang nuôi sáng. A: nuôi tối 9 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày.
Hình 3.5. Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 12 ngày và chuyển sang nuôi sáng. A: nuôi tối 12 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày.
Hình 3.6. Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 15 ngày và chuyển sang nuôi sáng.
A: nuôi tối 15 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày.
A B
A B
B A
3.3. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng đến ph t triển quả thể nấm
3.3.1. Ảnh hưởng độ ẩm phòng nuôi đến phát triển quả thể nấm
Tằm sau khi gây nhiễm nấm và nuôi tối 12 ngày đƣợc chuyển ra nuôi sáng với cƣờng độ ánh sáng giàn đ n Led 700 lux, thời gian chiếu sáng 12 h/ngày, nhiệt độ 22OC và với các độ ẩm phòng nuôi khác nhau. Kết quả thu đƣợc sau 40 ngày nuôi sáng đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.4. Kết quả cho thấy, điều kiện độ ẩm phòng nuôi khác nhau ảnh hƣởng đến tỷ lệ tằm bật mầm quả thể, số lƣợng quả thể/con và chiều dài quả thể. Ở công thức độ ẩm 80% cho tỷ lệ tằm bật mầm quả thể thấp nhất (83,5%) và số quả thể chỉ đạt trung bình 0,9 quả/con, chiều dài quả thể cũng ngắn nhất 2,2 cm. Ở điều kiện độ ẩm phòng nuôi 85% và 90% cho tỷ lệ tằm bật mầm quả thể cao nhất (98,3% và 97,5% tƣơng ứng); số lƣợng quả thể trung bình/con cũng nhiều nhất (1,4 và 1,17 quả thể/con tƣơng ứng) và chiều dài quả thể cũng dài nhất (4,5 cm và 4,2 cm tƣơng ứng). Khi tăng độ ẩm phòng nuôi lên 95% thì tỷ lệ tằm bật mầm quả thể giảm chỉ còn 90,9%; trung bình 1,09 quả thể/con và chiều dài quả thể chỉ đạt 3,5 cm.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện độ ẩm phòng nuôi thích hợp cho nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo C. militaris trên tằm nguyên con là từ 85 – 90%.
Theo Sung et al, (2006) thì khoảng ẩm độ thích hợp cho nấm sinh