V ẬT LIỆU À PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.7.1. Nối sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng
Dòng hóa là quá trình đưa đoạn DNA ngoại lai (sản phẩm RT-PCR) gắn vào trong hệ gen của một vòng DNA đã được thiết kế sẵn gọi là plasmid, nhằm tạo ra vector tái tổ hợp. Sau đó plasmid chứa DNA ngoại lai này được chuyển nạp (transformation) vào tế bào khả biến (competent cell) để nhân lên với số lượng lớn và tách DNA plasmid chứa sản phẩm PCR chèn vào (gọi là plasmid tái tổ hợp). Nếu sản
phẩm PCR có độ dài ngắn (dưới 2 kb), thông thường dễ dàng được gắn trực tiếp vào
vector tách dòng theo cơ chế bổ sung adenin (A) của đầu 3’ ở sản phẩm PCR với Thymin (T) ở đầu 3’ của vector (plasmid) đã được thiết kế theo cơ chế tách dòng TA. Plasmid được sử dụng nhiều hiện nay là loại vector pCRÒ2.1-TOPOÒ của hãng Invitrogen (Hình 2.2).
.
Hình 2.2 Cấu trúc của vector pCRÒ2.1- TOPOÒ (Invitrogen Inc.)
Vector pCRÒ2.1- TOPOÒ có kích thước là 3,9 kb, được thiết kế có hai nucleotide Thymin (T) nằm ở hai đầu biên của vùng ”đa nối” MCS (mutiple cloning
site) của vector. Các đoạn DNA của sản phẩm của phản ứng PCR/RT-PCR, được gắn thêm một nucleotide Adenin (A) ở cuối đầu 3’ nhờ enzym Taq DNA-polymerase. Các nucleotide này sẽ liên kết bổ sung với các nucleotide Thymin của vector trong quá trình ghép-nối sản phẩm PCR vào vector tạo thành một plasmid tái tổ hợp đóng vòng khép kín. Tại hai đầu của vùng MCS, có bố trí điểm cắt của enzym giới hạn EcoRI để
thuận lợi cho quá trình kiểm tra sản phẩm tách dòng.
Ngoài ra, vector pCRÒ2.1-TOPOÒ cũng chứa các gen mã hoá cho các protein enzym cần thiết trong qua trình chọn lọc các plasmid tái tổ hợp (gen kháng kháng sinh, operon-lac), các điểm khởi đầu sao chép như các vector tách dòng khác. Operon-Lac
chứa gen mã hoá cho enzym b-galactosidase (lacZ) nằm trong vùng MCS, có khả năng
thuỷ phân một loại cơ chất sinh màu là X-gal. Nếu sản phẩm PCR được gắn vào vector
thì sẽ làm bất hoạt gen lacZ. Do đó, các vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên
khuẩn lạc màu trắng, còn các vi khuẩn mang vector pCRÒ2.1- TOPOÒ không mang gen
ngoại lai sẽ tạo nên khuẩn lạc màu xanh.
Thành phần phản ứng:
Vector pCR2.1TOPO: 1 µl
Nước tinh khiết: 2 µl
Sản phẩm PCR: 2 µl
Dung dịch muối: 1 µl
Tổng số: 6 µl
Để ở nhiệt độ phòng (15 - 25oC) trong 5 phút. Tiến hành chuyển nạp.