Chỉ tiêu vi sinh - Quy trình sản xuất xúc xích heo- 123docz.net

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

4.2.3.1. Giới hạn cho phép của các vi sinh vật có trong sản phâm chế biến từ thịt Bảng 4.2. Bảng chỉ tiêu vi sinh vật có trong sản phẩm chế biến tù' thịt (TCVN: 7049 - 2002)

4.2.3.2.Phương pháp xác định một số chỉ tiêu vỉ sinh vật • Xác định tổng sổ vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm

- Định nghĩa

Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tông số vi khuan hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.

- Nguyên tắc

Tông số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đô đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí

ở 30°c/72h ± 6h hoặc 37°c/48h ± 6h.

- Quy trình phân tích

25g mẫu + 225ml BPW —> đồng nhất trong 30 giây —> độ pha loãng 10 1

Pha loãng trong nước muối sinh lý —» độ pha loãng 10'2, 10„3, 10 ~4

Từ mồi độ pha loãng cấy lml trên 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường PCA đã

được làm nguội đến 45 °c

VI SINH VẬT MỨC TỐI ĐA

Tông sô vi sinh vật hiêu khí (cfii/g) 104

Conforms (cfu/g) 50

Escherichia coli (cfii/g) 0

Clostridium perfringens (cfli/g) 10

Salmonella (trong 25g) Không phát hiện

Listeria monocytogenes (trong 25g) Không phát hiện

Staphylococcus aureus (cfu/g) 100

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội —» úp ngược —> đcm ủ ở nhiệt độ 30 c trong 72h

Đọc kết quả các kết quả từ 25 250 khuẩn lạc-

Tính toán kết quả: N

A = --- n,V f,+...+n1 iVifi

Sơ đồ 4.1. Quy trình phân tích xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong sản phẩm

- Thuyết minh quy trình + Chuân bị mẫu

Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung dịch pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu bàng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 2,5 phút. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng 10'1.

Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bàng cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuyển lml vào ổng nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng —» đồng nhất, ta sê có được dịch pha loãng 10' . Tiếp tục thực hiện tương tự đê có được các độ pha loãng cần 2

thiết.

+ Đổ đĩa

Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến từ 30 300 tế bào vi sinh vật. Dùng - micropipette với các đầu tip vô trùng để chuyển lml dịch pha loãng vào giừa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mồi độ pha loãng cấy từ 2 3 đĩa. Sau khi cấy, đố vào mỗi đĩa 10- - 15ml môi trường PCA đã nấu chảy làm nguội đến 45 50°C. Trộn đều mẫu vào môi trường bàng cách xoay - tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ tù- 3-5 lần. Đặt lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc.

+ ủ

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

36 + Đọc kết quả

Hình 4.1. Tông số vi sinh vật hiếu khí

Đem tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 30- 300 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong lg mẫu được tính như sau:

N A (cfU/g) = ---

n,Vf, + ....+ rijVfj Trongđó : A: số tế bào vi khuẩn(khuẩn lạc) trong lg mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng

• Xác định tong so Conforms

- Định nghĩa Conforms

Conforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37°c trong 24 48 giờ. Nhóm -

Colifonns hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong một người và động vật. Conforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.

- Nguyên tắc

Mầu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích họp chứa lactose. Sau khi ủ 37°c ± l°c trong 24 - 48 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

Conforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc Conforms

là môi trường chứa lactose. Đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời môi trường còn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và các tác nhân chỉ thị như neutral red, crystal violet. Khẳng định các dòng khuấn lạc đặc trưng bằng môi trường canh chọn lọc như canh BGBL.

- Quy trình phân tích

25g mẫu + 225ml BPW —> đồng nhất trong 30 giây —> độ pha loãng 10"1

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1 ml trên 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 45°c và chờ trong 30

Đố môi trường VRB lên môi trường TSA

ủ nhiệt độ 37°c trong 24h

Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ sen đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm

Ở mồi đĩa chọn 3 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường- BGBL

ử 37°c ± trong 24 giờ

Tỷ lệ xác nhận R:

Sổ khuân lạc sinh hơi trong BGBL

R = --- ———— --- ---

Số khuẩn lạc đã cấy

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

A= --- X R

nVf

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

Hình 4.2. Khuẩn lạc Conformstrên môi trường VRB

- Thuyết minh quy trình + Chuẩn bị mẫu

+ Cấy mẫu

Cấy chuyền lml dung dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mồi nồng độ cấy ít nhất vào đĩa và chọn nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mồi đĩa xuất hiện 2 2 từ 10 - 100 khuẩn lạc.

Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội

đến 45°c, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược

chiều kim đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 - 2 giờ để phục hồi khả năng của

Conforms. Đô thêm 10 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông đặc, lật ngược đĩa và - ủ ở 37 ± l°c trong 24h.

+ Đọc kết quả

Chọn các đĩa có số đếm tù‟ 10 - 100 khuân lạc Conforms đê tính. Khuân lạc

Conforms có màu đỏ đến đỏ sậm và đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

40 + Khẳng định

Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyền sang môi trường canh BGBL và ủ ớ 37°c

trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Dumham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với sổ khuẩn lạc khẳng định.

Hình 4.3. Kết quả khăng định Conforms trên môi trường BGBL + Tính toán kết quả

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Conforms theo

công thức:

A(cfu/g hay cfu/ml) = --- X R

n! vf*! + ... + rijvfi

Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mồiđộ pha loãng v: thể tích cấy vào mỗi đĩa

fì: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đém R: tỷ lệ xác nhận

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

41 thập phân.

• Định tính E. Coli

- Định nghĩa

Conforms là nhũng trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở nhiệt độ 37°c trong 24 - 48 giờ.

Conforms chịu nhiệt là Coiifonns có khả năng lên men lactose, sinh acid và sinh hơi ở nhiệt độ 44°c trong 24 - 48 giờ.

Conforms phân (feacal Coliform) là Coliform nhiệt có thử nghiệm indol trong môi trường trypton dương tính

E.Cuỉỉ là Coỉỉ/onns phân có nghiệm pháp IMVic lần lượt là + + -

- Nguyên tắc

Phương pháp này dung đê định tính và kêt luận phát hiện hay không phát hiện E.Coỉi trong một khối lượng mẫu xác định.

Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh (BGBL), kiểm tra trên môi trường phân lập (EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa phù họp (nghiệm pháp IMViC).

- Quy trình phân tích

Cân 25g mẫu + 225ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây —> độ pha loãng 10"'

Lấy lml mẫu ở độ pha loãng ìcr'cho vào lOml môi trường BGBL

ủ ở 44°c ± 0,5 trong 24 giờ

Chọn các ống sinh hơi cấy chuyền sang môi trường EMB. Mầu không sinh hơi đươc coi là âm tính

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

ủ ớ 37°c ± 0,5 trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên EMB: tròn lồi, đường kính <0,5mm, có ánh kim tím

Cấy chuển sang TSA —» ủ ở 37°c ± 0,5 trong 24 giờ

Cấy vào môi trường 1 trypton, 2 MR - VP, 1 Simmons Citrate

ủ ớ 37°c ± 0,5 trong 24 giờ

Sử dụng các loại thuốc để test thử nghiệm IMViC

Kết luận

Sơ đồ 4.3. Quy trình Định tính E.Coìi

- Thuyết minh quy trình + Chuấn bị mẫu

Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung dịch pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 2,5 phút. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng 10‟1.

+ Tăng sinh

Cấy lml mẫu đã pha loãng ở nồng độ ‟ vào ống nghiệm chứa lOml canh BGBL, ủ 10

44°c trong 24 giờ.

+ Phân lập

Sau 24 giờ , chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục và có sinh hơi) và cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB. ủ ở 37°c trong 24

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

Nhận dạng khuẩn lạc E.Cơỉi : Khuẩn lạc tròn, màu tím, có bờ đều, đường kính 0,5 mm, có ánh kim tím.

Hình 4.4. Khuân lạc đặc trưng của E.Coỉi trên môi trường EMB + Khẳng định

Những khuẩn lạc nghi ngờ được thực hiện qua các bước thử nghiệm sinh hóa (thực hiện nghiệm pháp IMViC).

Chọn ít nhất 2 khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy chuyền sang môi trường rắn không chọn lọc (môi trường TSA), ủ ở 37°c trong 24 giờ.

Các thử nghiệm sinh hóa được dùng khẳng định E.Cuỉi như sau:

+ Báo cáo kết quả

Phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 25g mẫu. • Định tính Samonella.

- Định nghĩa

Saỉmonella là loại trực khuấn, gram (-), yếm khí tùy tiện, dài 2-3 |j.m, không sinh bào

STT Thử nghiệm sinh hóa Kêt quả

1 Indol +

2 Methyl Red +

3 Voges Proskauer -

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indol, không phân giải urê, sinh H2S.

Saỉmonella có nhiều trong các loại thịt tươi sống, cá, trúng, sữa, các loại thức ăn cho gia súc.

- Nguyên tắc

Phát hiện có hay không Saỉmưneìỉa trong khối mẫu xác định. Quy trình phát hiện

Salmonella trong thực phẩm được thực hiện qua 4 bước:

+ Tiền tăng sinh + Tăng sinh chọn lọc + Phân lập + Khăng định + Môi trường LDC

- Quy trình thực hiện

Cân 25g mẫu + 225ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây —» độ pha loãng 10‟1

Đem ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24h

Lấy 0,1 ml canh trường cho vào 10ml môi trường RV

ủ ở 42°c ± 0,5 trong 24 giờ

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

Khuẩn lac đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường quanh chuyến sang đỏ

Cấy chuyển sang môi trường TSA

ủ ớ 37°c trong 24 giờ

Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI, Mannitol, phenol red broth, Urea broth, LDC both

ủ ở 37°c trong 24 giờ

Biểu hiện đặc trung của Salmonella: Trên TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+); Mannitol(+); ưrea(.), LDC( ) +

Ket luận: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25g mẫu

Sơ đồ 4.4. Quy trình định tính Samonelỉa

- Thuyết minh quy trình + Tiền tăng sinh

Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thường: cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng. Thêm 225ml dung dịch peptone đệm và đồng nhất mẫu. Thời gian đồng nhất mẫu có thể là 15 hoặc 30 giây tùy theo từng loại mẫu. ử 37°c trong 24 giờ.

+ Tăng sinh chọn lọc Trộn môi trường canh sau sau khi đã ủ 24 giờ trước khi cấy chuyển 0,1 mm sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV. Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 42°c

Quy trình sản xuất xúc xích heo thanh trùng SVTH: Nguyễn Thị Diệp

46 + Phân lập

Dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc Salmonella là môi trường XLD. Trên môi trường XLD, khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc. Môi trường XLD chuyển sang màu hồng.

Hình 4.5. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 37°c trong 22 - 26 giờ. Sau khi ủ, chọn những khuân lạc nghi ngờ Saỉmoneỉỉa đê khăng định băng các thử nghiệm sinh hóa và thừ nghiệm các đặc tính kháng nguyên.

+ Khẳng định

Khuân lạc nghi ngờ là Salmoneỉla phải được kiêm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ mỗi môi trường phân lập, cấy chuyên ít nhất 5 khuấn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (môi trường TSA), ủ ở 37°c trong 24 giờ, các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường