Ng 3.2 Đánh giá ñ im vi sinh

Một phần của tài liệu KHẢO SÁT TÌNH TRẠNG NHIỄM CÁC LOÀI VI SINH VẬT STAPHYLOCOCCUS SPP, PSEUDOMONAS SPP, CORYNEBACTERIUM SPP VÀ NẤM MEN MALASSEZIA TRÊN CHÓ BỊ BỆNH VIÊM TAI NGOÀI (Trang 30 - 37)

trong vi trư ng (x1000) ñ m ñư c S ñi m <1 0 1-3 1 4-5 2 6-10 3 >10 4 (Ngu n: Jasmin P, 2003)

3.5.2. Nuôi c(y vi khu3n và th@ kháng sinh ñA

3.5.2.1. Phương pháp c(y

• Nguyên t'c

M)c ñích c=a vi c c y phân l p là tách các vi sinh v t ra t"ng t bào riêng bi t ñ

t" ñó thu ñư c các dòng vi sinh v t thu n khi t ph)c v) cho vi c nghiên c u chúng. Phương pháp này d a trên nguyên t'c là mGi m$t t bào vi sinh v t sau m$t th i gian nuôi c y (24 gi ) trên môi trư ng th ch dinh dư ng thích h p sF phát tri n thành m$t khóm vi sinh v t và ñư c g i là khu#n l c. Như v y, mGi khu#n l c ñư c tính như là m$t t bào vi sinh v t. Khu#n l c thư ng có kích thư c 0,5 ñ n 4 – 5 mm và có th nhìn th y ñư c b ng m't thư ng. Trong khi ñó, mu n th y ñư c các t bào vi sinh v t chúng ta ph i dùng kính hi n vi. Các t bào vi sinh v t càng ñư c tách r i nhau, nh ng khu#n l c t o nên sF càng riêng bi t, rõ nét, càng giúp cho vi c ch n l a các dòng thu n ñư c d dàng hơn.

• Môi trư ng và d)ng c)

- Môi trư ng: vi c c y phân l p ñư c th c hi n trên môi trư ng th ch ñĩa (tuỳ

theo lo i vi sinh v t c n phân l p mà ch n l a lo i môi trư ng thích h p. Ví d): môi trư ng EMB, môi trư ng Endo dùng phân l p vi khu#n E.coli, môi trư ng SS dùng phân l p vi khu#n Salmonella, Shigella,…)

- D)ng c): que c y vòng, hay que trang, ñèn c n.

• Các bư c phân l p - Thao tác c y:

+ C y phân l p trên môi trư ng th ch ñĩa

Tay thu n c m que c y có d ch m u, tay còn l i c m ñĩa môi trư ng trong lòng bàn tay. Dùng ngón tay cái c=a bàn tay c m ñĩa môi trư ng ñ#y nh% n'p ñĩa lên, các ngón tay khác ñ nh% n'p h$p. Đưa kim c y có vòng d ch vào ph m vi c=a ñĩa, r i ria nh% nhàng que c y có d ch vi sinh v t c n phân l p lên trên b m&t môi trư ng th ch thành nh ng ñư ng khác tách nhau. C n ph i chú ý r ng, t t c các thao tác ñư c th c hi n trong quá trình phân l p ph i là nh ng thao tác vô trùng (vô trùng que c y trư c khi l y d ch c y và sau khi th c hi n xong các thao tác, c y bên ng n l a ñèn c n,…). Có nhi u cách th c hi n ñư ng ria c y phân l p. M$t trong nh ng cách ñơn gi n nh t

ñư c th c hi n như sơñ dư i ñây:

Hình 3.1. Các ñư ng c y phân l p vi khu#n và n m

Theo cách c y ñư c trình bày trên hình vF, s phân b c=a vi sinh v t trên b m&t th ch ñĩa như sau:

Vùng s 1: vi sinh v t m c nhi u và dày nh t, thông thư ng không có các khu#n l c riêng bi t.

Vùng s 2: vi sinh v t m c ít hơn so v i vùng 1, ñã có th th y các khu#n l c riêng bi t trên b m&t th ch.

Vùng s 3: vi sinh v t m c ít hơn so v i vùng 2, có nhi u khu#n l c riêng bi t trên b m&t th ch.

Vùng s 4: vi sinh v t m c ít nh t so v i các vùng khác, các khu#n l c m c riêng bi t trên b m&t th ch.

Sau khi c y, kim c y ph i ñư c ñ t ñ vô trùng.

- Thao tác v i ñĩa môi trư ng th ch trư c và sau khi c y:

Các ñĩa môi trư ng trư c và sau khi c y ph i ñư c ñ&t v trí úp ngư c, nghĩa là

ñ&t m&t n'p c=a ñĩa môi trư ng xu ng dư i. V i thao tác này sF giúp tránh ñư c s nhi m t" ngoài vào do vi c m n'p m$t cách tình c c=a m$t ngư i khác. Thao tác này còn h n ch ñư c s tích t) hơi nư c trên m&t n'p và ngăn không cho nư c rơi trên b m&t th ch, m&t th ch sF ñư c gi khô và vi c tách khóm vi sinh v t sF có k t qu t t hơn.

Ghi chú c#n th n tên m u, ngày c y,… trên các ñĩa ñã ñư c c y phân l p xong và ñ&t chúng vào t= m nhi t ñ$ thích h p. Đ c k t qu sau 24 gi nuôi c y.

(Nguy n Ng c H i – Tô Minh Châu, 2004)

3.5.2.2. Đ0c k t qu$, th@ sinh hóa

K t qu ñư c ñ c sau 24 gi , n u sau 24 gi khu#n l c nhE quá thì sau 48 gi ñ c ti p. Ghi nh n các lo i khu#n l c có m&t trên ñĩa th ch g m hình d ng, màu s'c, kích thư c, ñ$ bóng, ñ$ trơn nhăn,… Ti n hành nhu$m gram, th ph n ng catalase, oxydase cho mGi d ng khu#n l c.

• Nhu$m Gram:

- Thu c nhu$m và hoá ch t Thu c nhu$m:

+ Crystal violet

+ Fuchsin ki m loãng (màu ñE) Hoá ch t:

+ Dung d ch Lugol (dung d ch Iod): dung d ch này sF tác d)ng v i Crystal violet t o nên m$t h p ch t b n màu, ñóng vai trò trong vi c c ñnh màu tím

vi khu#n.

+ C n 960: có tác d)ng t#y màu tím vi khu#n Gram âm, t o ñi u ki n cho chúng b't màu ñE c=a Fuchsin.

- K thu t nhu$m

+ Làm v t bôi trên lam

+ NhE thu c nhu$m Crystal violet lên mi ng gi y l c sao cho ñ= th m xu ng v t bôi, ñ 1-2 phút.

+ R a nư c

+ NhE dung d ch Lugol lên v t bôi v"a ñư c nhu$m, ñ kho ng 1 phút + R a nư c

+ T#y màu nhanh b ng c n 960 , kho ng 15-30 giây + R a nư c

+ Đ&t m$t m nh gi y l c khác lên v t bôi

+ NhE thu c nhu$m Fuchsin ki m loãng lên mi ng gi y l c sao cho ñ= th m xu ng v t bôi, ñ kho ng 1 phút.

+ R a nư c

+ Th m khô tiêu b n ñ xem dư i kính hi n vi. - K t qu nhu$m

Vi khu#n Gram dương b't màu tím c=a thu c nhu$m Crystal violet, vi khu#n Gram âm b't màu h ng c=a Fuchsin.

(Nguy n Ng c H i – Tô Minh Châu, 2004).

• Ph n ng catalase: - Nguyên t'c:

Các vi sinh v t hi u khí b't bu$c hay hi u khí tùy nghi nh có enzyme catalase nên thư ng có kh năng phân gi i H2O2 t o thành nư c và oxy. Trong ph n ng catalase dương tính, oxy sF bay lên t o thành b t khí.

H2O2 H2O + ½ O2

- Thu c th : Nư c oxy già (H2O2) - Th c hi n:

Dùng que c y vòng, b ng thao tác vô trùng, l y và tr i vi sinh v t ki m ñnh lên m$t mi ng lam s ch. Sau ñó, nhE vài gi t nư c oxy già lên chG có vi sinh v t ki m

ñnh. Ph n ng x y ra ngay l p t c. - Đánh giá k t qu :

Quan sát s xu t hi n b t khí:

+ Có xu t hi n b t khí: oxy ñư c sinh ra bay lên. Ph n ng catalase dương tính. + Không có xu t hi n b t khí: không có oxy ñư c sinh ra. Ph n ng catalase âm tính.

• Ph n ng oxydase: - Nguyên t'c:

Tính ch t này thư ng có vi sinh v t hi u khí. Enzyme cytochrome oxydase c=a vi sinh v t sF oxy hóa tetramethyl paraphenylen diamine chlohydrate có trong thu c th t o thành h p ch t có màu tím ñen.

- Thu c th :

Dung d ch 1% tetramethyl paraphenylen diamine chlohydrate t#m sQn trên gi y th . - Th c hi n:

Dùng que c y vòng, b ng thao tác vô trùng, l y và tr i vi sinh v t ki m ñnh lên m u gi y có t#m thu c th . Đ c k t qu sau vài giây (không c n = và nuôi c y).

- Đánh giá k t qu :

Quan sát s xu t hi n màu trên m u gi y t#m thu c th :

+ Có xu t hi n màu tím ñen: ph n ng oxydase dương tính. + Không xu t hi n màu tím ñen: ph n ng oxydase âm tính.

(Nguy n Ng c H i – Tô Minh Châu, 2004)

3.5.2.3. Đ)nh nhóm vi khu3n

Các vi khu#n c n kh o sát ñư c ñnh nhóm sau khi ñã hoàn thành các bư c trên.

Đnh nhóm vi khu#n theo cây phân lo i c=a Quinn (1994) (xin xem ph n ph) l)c).

Staphylococcus

- Ch n nh ng khu#n l c trên th ch máu có ñ&c ñi m tròn, l i, bóng, có th tr'ng ho&c trong, dung huy t ho&c không.

- Th ph n ng catalase, oxydase. Ch n nh ng khu#n l c cho ph n ng catalase (+), oxydase (-).

- Nhu$m gram. Staphylococcus là nh ng c u khu#n b't màu tím gram (+), có d ng chùm t) c u. Đư ng kính c u khu#n vào kho ng 1µm.

Corynebacterium

- Ch n nh ng khu#n l c tròn, l i, bóng, trong, không dung huy t trên th ch máu.

- Th ph n ng catalase cho ph n ng dương tính và âm tính v i ph n ng oxydase.

- Nhu$m gram. Corynebacterium là nh ng tr c khu#n gram dương b't màu tím và có hình d ng tròn 2 ñ u. Vi khu#n thư ng ñ ng riêng rF ho&c s'p x p góc nh n v i nhau.

Pseudomonas spp

- Trên th ch MC ch n nh ng khu#n l c có d ng nhám, nâu, b ng, ñư ng kính khu#n l c l n t" 3-4 mm trong 24 gi và có xu hư ng lan ra r t nhanh.

- Th ph n ng catalase cho ph n ng dương và cũng dương tính v i ph n ng oxydase.

- Nhu$m gram và xem kính hi n vi ñ$ phóng ñ i 1000 l n v i d u soi kính th y Pseudomonas là nh ng tr c khu#n gram âm, kích thư c kho ng 0,5 x 1µm.

3.5.2.4. Th@ kháng sinh ñA

Đ i v i mGi vi khu#n phân l p ñư c chúng tôi ti n hành làm kháng sinh ñ ñ

th ñ$ nh y c=a nh ng vi khu#n ñó v i các lo i kháng sinh. Ch n các lo i kháng sinh làm kháng sinh ñ thông thư ng là lo i kháng sinh ñ i di n cho nhóm và không thu$c lo i kháng t nhiên c=a vi khu#n (Ví d) : Staphylococcusñ kháng t nhiên v i beta – lactam thì không nên dùng thu c thu$c nhóm này,…). V i Staphylococcus thì chúng tôi th v i 12 lo i kháng sinh là Ac, Bt, Kn, Er, Ge, Te, Va, Nr, Sm, Cp, Ne, Dx. V i

Corynebacterium chúng tôi cũng ti n hành th v i 12 lo i kháng sinh trên. Th v i

Pseudomonas chúng tôi dùng 13 lo i kháng sinh là Bt, Dx, Cp, Ne, Ge, Tb, Nr, Ac, Co, Am, Te, Sm, Kn.

3.5.3. Phân l'p n(m men

Hình 3.3. N m men Malassezia pachydermatis (nh ng t bào n m r i r c phía trên, có th th y rõ vách ngăn gi a)

(Ngu n: http://www3.unileon.es/personal/wwdmvjrl/dermatopatias/malassezia.htm)

Nuôi c y n m men Malassezia ñư c th c hi n trên môi trư ng PDA (Potato Destrose Agar). Có 2 phương pháp c y phân l p n m men là phương pháp c y trang và c y ria. C y trang là ñưa m u vào m$t góc ñĩa môi trư ng sau ñó dùng que trang ñ

trang ñ u kh'p m&t ñĩa. Phương pháp ria c y gi ng như c y vi khu#n, b o qu n m u nhi t ñ$ phòng (kho ng 25 - 300C). Sau 2-3 ngày nhi t ñ$ phòng ti n hành ki m tra và ch n ra nh ng khu#n l c có d ng tròn, l i, tr'ng s a, hơi nhám. N u khu#n l c nhE

chưa phân bi t rõ thì có th ñ thêm 2-3 ngày n a.

Nhu$m ñơn v i crystal violet và xem kính ñ$ phóng ñ i 1000 l n v i d u soi kính. Nh n di n n m men Malassezia pachydermatis v i các ñ&c ñi m: là t bào hình cái chai, ñư ng kính 1-2 x 2-4µm. H gi a thân thư ng có vách ngăn.

3.6. XB LÝ S LI U

S li u ñư c theo dõi và thu th p trong su t giai ño n thí nghi m. S li u thu th p ñư c x lý b ng ph n m m Microsoft Excel 2003 và Minitab Version 14.

Chương 4

K T QU VÀ TH O LU N

Chúng tôi ti n hành kh o sát trên t(ng s 30 m u l y trên tai chó viêm. Qua quá trình kh o sát chúng tôi thu ñư c nh ng k t qu sau:

4.1. LÂM SÀNG 4.1.1. Nhi&m chung

M c ñ$ b nh trên các ca kh o sát ñư c th hi n b ng 4.1

Một phần của tài liệu KHẢO SÁT TÌNH TRẠNG NHIỄM CÁC LOÀI VI SINH VẬT STAPHYLOCOCCUS SPP, PSEUDOMONAS SPP, CORYNEBACTERIUM SPP VÀ NẤM MEN MALASSEZIA TRÊN CHÓ BỊ BỆNH VIÊM TAI NGOÀI (Trang 30 - 37)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(63 trang)