Là bư c ñ u c=a quá trình phân tích vi sinh. Cách th c hi n như sau:
- Chu#n b m$t lam s ch có kO khung sQn. Khung hình vuông có di n tích 2cm2 n m gi a lam.
- Ph t m u lên m&t dư i c=a lam t c là m&t không ch a các ñư ng kO, m)c ñích là ñ khi nhu$m tiêu b n thì không làm phai khung kO.
- Phương pháp nhu$m: Ta ti n hành nhu$m b ng phương pháp nhu$m ñơn v i crystal violet. Phương pháp nhu$m như sau:
+ Dùng tăm bông ch a m u ph t ñ u lên khung kO 2cm2 . Đ m u khô t nhiên ho&c hơ nh% qua ng n l a ñèn c n.
+ Dùng mi ng gi y l c ph= lên v t bôi.
+ NhE crystal violet và ñ trong vòng 2 phút
+ R a m u b ng vòi nư c nh%, có th ñ nghiêng lam và cho vòi nư c nh% ñi qua cho ñ n khi màu tím không phai n a.
+ Đ khô t nhiên và nhE d u soi kính, xem ñ$ phóng ñ i 1000 l n. - Đ m t t c các vi sinh v t bao g m c u khu#n, tr c khu#n, c u tr c khu#n, n m men, … có trong mGi vi trư ng. Đ m t t c 10 vi trư ng phân b ñ u trên lam. V i mGi vi trư ng ta ghi nh n t"ng lo i vi sinh theo b ng 3.1.
B$ng 3.1. B ng ñ m tươi vi sinh v t S th t lam Vi trư ng N m men C u khu#n Tr c khu#n T(ng c$ng 1 2 3 4 … 10 Trung bình Đi m vi sinh:
B$ng 3.2.Đánh giá ñi m vi sinh S lư ng vi sinh v t trung bình S lư ng vi sinh v t trung bình trong vi trư ng (x1000) ñ m ñư c S ñi m <1 0 1-3 1 4-5 2 6-10 3 >10 4 (Ngu n: Jasmin P, 2003)
3.5.2. Nuôi c(y vi khu3n và th@ kháng sinh ñA
3.5.2.1. Phương pháp c(y
• Nguyên t'c
M)c ñích c=a vi c c y phân l p là tách các vi sinh v t ra t"ng t bào riêng bi t ñ
t" ñó thu ñư c các dòng vi sinh v t thu n khi t ph)c v) cho vi c nghiên c u chúng. Phương pháp này d a trên nguyên t'c là mGi m$t t bào vi sinh v t sau m$t th i gian nuôi c y (24 gi ) trên môi trư ng th ch dinh dư ng thích h p sF phát tri n thành m$t khóm vi sinh v t và ñư c g i là khu#n l c. Như v y, mGi khu#n l c ñư c tính như là m$t t bào vi sinh v t. Khu#n l c thư ng có kích thư c 0,5 ñ n 4 – 5 mm và có th nhìn th y ñư c b ng m't thư ng. Trong khi ñó, mu n th y ñư c các t bào vi sinh v t chúng ta ph i dùng kính hi n vi. Các t bào vi sinh v t càng ñư c tách r i nhau, nh ng khu#n l c t o nên sF càng riêng bi t, rõ nét, càng giúp cho vi c ch n l a các dòng thu n ñư c d dàng hơn.
• Môi trư ng và d)ng c)
- Môi trư ng: vi c c y phân l p ñư c th c hi n trên môi trư ng th ch ñĩa (tuỳ
theo lo i vi sinh v t c n phân l p mà ch n l a lo i môi trư ng thích h p. Ví d): môi trư ng EMB, môi trư ng Endo dùng phân l p vi khu#n E.coli, môi trư ng SS dùng phân l p vi khu#n Salmonella, Shigella,…)
- D)ng c): que c y vòng, hay que trang, ñèn c n.
• Các bư c phân l p - Thao tác c y:
+ C y phân l p trên môi trư ng th ch ñĩa
Tay thu n c m que c y có d ch m u, tay còn l i c m ñĩa môi trư ng trong lòng bàn tay. Dùng ngón tay cái c=a bàn tay c m ñĩa môi trư ng ñ#y nh% n'p ñĩa lên, các ngón tay khác ñ nh% n'p h$p. Đưa kim c y có vòng d ch vào ph m vi c=a ñĩa, r i ria nh% nhàng que c y có d ch vi sinh v t c n phân l p lên trên b m&t môi trư ng th ch thành nh ng ñư ng khác tách nhau. C n ph i chú ý r ng, t t c các thao tác ñư c th c hi n trong quá trình phân l p ph i là nh ng thao tác vô trùng (vô trùng que c y trư c khi l y d ch c y và sau khi th c hi n xong các thao tác, c y bên ng n l a ñèn c n,…). Có nhi u cách th c hi n ñư ng ria c y phân l p. M$t trong nh ng cách ñơn gi n nh t
ñư c th c hi n như sơñ dư i ñây:
Hình 3.1. Các ñư ng c y phân l p vi khu#n và n m
Theo cách c y ñư c trình bày trên hình vF, s phân b c=a vi sinh v t trên b m&t th ch ñĩa như sau:
Vùng s 1: vi sinh v t m c nhi u và dày nh t, thông thư ng không có các khu#n l c riêng bi t.
Vùng s 2: vi sinh v t m c ít hơn so v i vùng 1, ñã có th th y các khu#n l c riêng bi t trên b m&t th ch.
Vùng s 3: vi sinh v t m c ít hơn so v i vùng 2, có nhi u khu#n l c riêng bi t trên b m&t th ch.
Vùng s 4: vi sinh v t m c ít nh t so v i các vùng khác, các khu#n l c m c riêng bi t trên b m&t th ch.
Sau khi c y, kim c y ph i ñư c ñ t ñ vô trùng.
- Thao tác v i ñĩa môi trư ng th ch trư c và sau khi c y:
Các ñĩa môi trư ng trư c và sau khi c y ph i ñư c ñ&t v trí úp ngư c, nghĩa là
ñ&t m&t n'p c=a ñĩa môi trư ng xu ng dư i. V i thao tác này sF giúp tránh ñư c s nhi m t" ngoài vào do vi c m n'p m$t cách tình c c=a m$t ngư i khác. Thao tác này còn h n ch ñư c s tích t) hơi nư c trên m&t n'p và ngăn không cho nư c rơi trên b m&t th ch, m&t th ch sF ñư c gi khô và vi c tách khóm vi sinh v t sF có k t qu t t hơn.
Ghi chú c#n th n tên m u, ngày c y,… trên các ñĩa ñã ñư c c y phân l p xong và ñ&t chúng vào t= m nhi t ñ$ thích h p. Đ c k t qu sau 24 gi nuôi c y.
(Nguy n Ng c H i – Tô Minh Châu, 2004)
3.5.2.2. Đ0c k t qu$, th@ sinh hóa
K t qu ñư c ñ c sau 24 gi , n u sau 24 gi khu#n l c nhE quá thì sau 48 gi ñ c ti p. Ghi nh n các lo i khu#n l c có m&t trên ñĩa th ch g m hình d ng, màu s'c, kích thư c, ñ$ bóng, ñ$ trơn nhăn,… Ti n hành nhu$m gram, th ph n ng catalase, oxydase cho mGi d ng khu#n l c.
• Nhu$m Gram:
- Thu c nhu$m và hoá ch t Thu c nhu$m:
+ Crystal violet
+ Fuchsin ki m loãng (màu ñE) Hoá ch t:
+ Dung d ch Lugol (dung d ch Iod): dung d ch này sF tác d)ng v i Crystal violet t o nên m$t h p ch t b n màu, ñóng vai trò trong vi c c ñnh màu tím
vi khu#n.
+ C n 960: có tác d)ng t#y màu tím vi khu#n Gram âm, t o ñi u ki n cho chúng b't màu ñE c=a Fuchsin.
- K thu t nhu$m
+ Làm v t bôi trên lam
+ NhE thu c nhu$m Crystal violet lên mi ng gi y l c sao cho ñ= th m xu ng v t bôi, ñ 1-2 phút.
+ R a nư c
+ NhE dung d ch Lugol lên v t bôi v"a ñư c nhu$m, ñ kho ng 1 phút + R a nư c
+ T#y màu nhanh b ng c n 960 , kho ng 15-30 giây + R a nư c
+ Đ&t m$t m nh gi y l c khác lên v t bôi
+ NhE thu c nhu$m Fuchsin ki m loãng lên mi ng gi y l c sao cho ñ= th m xu ng v t bôi, ñ kho ng 1 phút.
+ R a nư c
+ Th m khô tiêu b n ñ xem dư i kính hi n vi. - K t qu nhu$m
Vi khu#n Gram dương b't màu tím c=a thu c nhu$m Crystal violet, vi khu#n Gram âm b't màu h ng c=a Fuchsin.
(Nguy n Ng c H i – Tô Minh Châu, 2004).
• Ph n ng catalase: - Nguyên t'c:
Các vi sinh v t hi u khí b't bu$c hay hi u khí tùy nghi nh có enzyme catalase nên thư ng có kh năng phân gi i H2O2 t o thành nư c và oxy. Trong ph n ng catalase dương tính, oxy sF bay lên t o thành b t khí.
H2O2 H2O + ½ O2
- Thu c th : Nư c oxy già (H2O2) - Th c hi n:
Dùng que c y vòng, b ng thao tác vô trùng, l y và tr i vi sinh v t ki m ñnh lên m$t mi ng lam s ch. Sau ñó, nhE vài gi t nư c oxy già lên chG có vi sinh v t ki m
ñnh. Ph n ng x y ra ngay l p t c. - Đánh giá k t qu :
Quan sát s xu t hi n b t khí:
+ Có xu t hi n b t khí: oxy ñư c sinh ra bay lên. Ph n ng catalase dương tính. + Không có xu t hi n b t khí: không có oxy ñư c sinh ra. Ph n ng catalase âm tính.
• Ph n ng oxydase: - Nguyên t'c:
Tính ch t này thư ng có vi sinh v t hi u khí. Enzyme cytochrome oxydase c=a vi sinh v t sF oxy hóa tetramethyl paraphenylen diamine chlohydrate có trong thu c th t o thành h p ch t có màu tím ñen.
- Thu c th :
Dung d ch 1% tetramethyl paraphenylen diamine chlohydrate t#m sQn trên gi y th . - Th c hi n:
Dùng que c y vòng, b ng thao tác vô trùng, l y và tr i vi sinh v t ki m ñnh lên m u gi y có t#m thu c th . Đ c k t qu sau vài giây (không c n = và nuôi c y).
- Đánh giá k t qu :
Quan sát s xu t hi n màu trên m u gi y t#m thu c th :
+ Có xu t hi n màu tím ñen: ph n ng oxydase dương tính. + Không xu t hi n màu tím ñen: ph n ng oxydase âm tính.
(Nguy n Ng c H i – Tô Minh Châu, 2004)
3.5.2.3. Đ)nh nhóm vi khu3n
Các vi khu#n c n kh o sát ñư c ñnh nhóm sau khi ñã hoàn thành các bư c trên.
Đnh nhóm vi khu#n theo cây phân lo i c=a Quinn (1994) (xin xem ph n ph) l)c).
Staphylococcus
- Ch n nh ng khu#n l c trên th ch máu có ñ&c ñi m tròn, l i, bóng, có th tr'ng ho&c trong, dung huy t ho&c không.
- Th ph n ng catalase, oxydase. Ch n nh ng khu#n l c cho ph n ng catalase (+), oxydase (-).
- Nhu$m gram. Staphylococcus là nh ng c u khu#n b't màu tím gram (+), có d ng chùm t) c u. Đư ng kính c u khu#n vào kho ng 1µm.
Corynebacterium
- Ch n nh ng khu#n l c tròn, l i, bóng, trong, không dung huy t trên th ch máu.
- Th ph n ng catalase cho ph n ng dương tính và âm tính v i ph n ng oxydase.
- Nhu$m gram. Corynebacterium là nh ng tr c khu#n gram dương b't màu tím và có hình d ng tròn 2 ñ u. Vi khu#n thư ng ñ ng riêng rF ho&c s'p x p góc nh n v i nhau.
Pseudomonas spp
- Trên th ch MC ch n nh ng khu#n l c có d ng nhám, nâu, b ng, ñư ng kính khu#n l c l n t" 3-4 mm trong 24 gi và có xu hư ng lan ra r t nhanh.
- Th ph n ng catalase cho ph n ng dương và cũng dương tính v i ph n ng oxydase.
- Nhu$m gram và xem kính hi n vi ñ$ phóng ñ i 1000 l n v i d u soi kính th y Pseudomonas là nh ng tr c khu#n gram âm, kích thư c kho ng 0,5 x 1µm.
3.5.2.4. Th@ kháng sinh ñA
Đ i v i mGi vi khu#n phân l p ñư c chúng tôi ti n hành làm kháng sinh ñ ñ
th ñ$ nh y c=a nh ng vi khu#n ñó v i các lo i kháng sinh. Ch n các lo i kháng sinh làm kháng sinh ñ thông thư ng là lo i kháng sinh ñ i di n cho nhóm và không thu$c lo i kháng t nhiên c=a vi khu#n (Ví d) : Staphylococcusñ kháng t nhiên v i beta – lactam thì không nên dùng thu c thu$c nhóm này,…). V i Staphylococcus thì chúng tôi th v i 12 lo i kháng sinh là Ac, Bt, Kn, Er, Ge, Te, Va, Nr, Sm, Cp, Ne, Dx. V i
Corynebacterium chúng tôi cũng ti n hành th v i 12 lo i kháng sinh trên. Th v i
Pseudomonas chúng tôi dùng 13 lo i kháng sinh là Bt, Dx, Cp, Ne, Ge, Tb, Nr, Ac, Co, Am, Te, Sm, Kn.
3.5.3. Phân l'p n(m men
Hình 3.3. N m men Malassezia pachydermatis (nh ng t bào n m r i r c phía trên, có th th y rõ vách ngăn gi a)
(Ngu n: http://www3.unileon.es/personal/wwdmvjrl/dermatopatias/malassezia.htm)
Nuôi c y n m men Malassezia ñư c th c hi n trên môi trư ng PDA (Potato Destrose Agar). Có 2 phương pháp c y phân l p n m men là phương pháp c y trang và c y ria. C y trang là ñưa m u vào m$t góc ñĩa môi trư ng sau ñó dùng que trang ñ
trang ñ u kh'p m&t ñĩa. Phương pháp ria c y gi ng như c y vi khu#n, b o qu n m u nhi t ñ$ phòng (kho ng 25 - 300C). Sau 2-3 ngày nhi t ñ$ phòng ti n hành ki m tra và ch n ra nh ng khu#n l c có d ng tròn, l i, tr'ng s a, hơi nhám. N u khu#n l c nhE
chưa phân bi t rõ thì có th ñ thêm 2-3 ngày n a.
Nhu$m ñơn v i crystal violet và xem kính ñ$ phóng ñ i 1000 l n v i d u soi kính. Nh n di n n m men Malassezia pachydermatis v i các ñ&c ñi m: là t bào hình cái chai, ñư ng kính 1-2 x 2-4µm. H gi a thân thư ng có vách ngăn.
3.6. XB LÝ S LI U
S li u ñư c theo dõi và thu th p trong su t giai ño n thí nghi m. S li u thu th p ñư c x lý b ng ph n m m Microsoft Excel 2003 và Minitab Version 14.
Chương 4
K T QU VÀ TH O LU N
Chúng tôi ti n hành kh o sát trên t(ng s 30 m u l y trên tai chó viêm. Qua quá trình kh o sát chúng tôi thu ñư c nh ng k t qu sau:
4.1. LÂM SÀNG 4.1.1. Nhi&m chung
M c ñ$ b nh trên các ca kh o sát ñư c th hi n b ng 4.1
B$ng 4.1. T l các m c ñ$ b nh trên các ca b nh
Tình tr ng lâm sàng Nh% Trung bình N&ng R t n&ng
S m u (n = 30) 5 7 11 7
T l (%) 16,7 23,3 36,7 23,3
T l các m c ñ$ b nh trên các ca b nh kh o sát nh%, trung bình, n&ng, r t n&ng l n lư t là 16,7%, 23,3%, 36,7%, 23,3%. T l các chó b viêm tai m c ñ$ nh% là th p nh t chi m 16,7%. 17% 23% 37% 23% Nh Trung bình N ng R t n ng Bi4u ñA 4.1. T l m c ñ$ b nh trên các ca b nh
T l ngoài th c t có th l n hơn nhi u vì khi chó b viêm tai m c ñ$ nh% thì ch= nuôi thư ng không phát hi n và mang chó ñi khám ch a. Đa s nh ng trư ng h p nh% là chúng tôi phát hi n khi ch= nuôi mang chó ñ n khám và ch a các b nh lý khác như b nh v da, tiêu hóa, hô h p …T l viêm tai m c ñ$ n&ng là cao nh t chi m 36,7%.
4.1.2. Các y u t=$nh hư1ng 4.1.2.1. Gi=ng
MGi gi ng chó có nh ng ñ&c ñi m riêng bi t v hình d ng ngoài c=a tai, thói quen và ho t ñ$ng. Đ&c ñi m v gi ng còn có liên quan ñ n s nh y c m c=a các b nh v da và tình tr ng d ng. Các y u t trên ñ u có th là m$t trong nh ng nguyên nhân kh i phát ho&c là ñi u ki n m ñư ng c=a b nh viêm tai ngoài (Calotti, 2002). Chúng