Thời gian: Từ tháng 03 năm 2011 đến tháng 07năm 2011.
Địa điểm: Tổ Kiểm hóa, Phòng Kiểm Định, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang.
2.2. Nguyên vật liệu
Thiết bị.
+ Cân phân tích Denver Instrument – AA 250. + Máy quang phổ Helios – Thermo – Anh. + Cóng đo bằng thạch anh dày 1cm.
+ Máy ly tâm Rotina 35 – HETTICH – Đức. + Máy lắc ống nghiệm Minishaker.
+ Nồi hấp cách thủy MEMMERT – Đức. + Tủ sấy MEMMERT (1300C).
+ Micro pipette 20 – 200 l (+đầu côn) – 720070 – Biohit. + Micro pipette 100 – 1000l (+đầu côn) – 720060 – Biohit. + Accu – jet – Brand
+ Bình khai triển
+ Bình phun sắc ký TLC Sprayer. + Máy copy hoặc scanner.
Dụng cụ:
+ Tube nhựa có nắp 1,5ml; 2ml; 5ml.
+ Tube 13 ; 18 x 100 mm – Pyrex ® - USA. + Pipet 10ml – 1/10 ±0,05 ml – Brand – Đức. + Pipet 5ml - 1/20±0,03 ml – Brand – Đức. + Pipet 2ml – 1/10 ± 0.02ml – Brand – Đức. + Bình định mức 50ml ± 0,25ml – Duran - Đức. + Bình định mức 100ml ± 0.10ml – Duran – Đức.
+ Bình định mức 1000ml ± 0.4ml – Duran – Đức. + Bình tia nước cất bằng nhựa (ngoại).
+ Bản silicagel.
2.3. Phương pháp
2.3.1. Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry. a. Nguyên lý
Protein có trong mẫu thử đã pha loãng (nếu cần) được ổn định bằng DOC rồi cho kết tủa với TCA. Đây là bước quan trọng để loại bỏ mọi yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Sau đó kết tủa sẽ được hòa tan và định lượng theo phương pháp Lowry. Protein phản ứng với đồng tactrate và thuốc thử Folin trong môi trường kiềm tạo phức màu xanh da trời có thể đo màu bằng quang phổ kế ở bước sóng 750nm.
b. Hóa chất, thuốc thử và dung dịch chuẩn.
Hóa chất:
+ Albumin Bovine – Initial fractionation by heat shock – Fraction V, minimum 98 % - sigma A – 7906.
+ Ampoule Protein Standards 1mg BSA/ml – Sigma – P0914. + Nước cất 2 lần.
+ Sodium deoxycholate (DOC) – Merck – 1.06504. + Trichloroacetic Acid (TCA) – p.a. – Merck – 1.00807. + Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) – Merck – 1.59717. + Sodium Hydroxide – e.p. – Merck – 1.06482.
+ Sodium carbonate – e.p. – Merck – 1.06398. + Copper (II) Sulphate – p.a. – Merck – 1.02791.
+ Potassium Sodium Tartrate – p.a. – Merck - 1.08087. + Folin Ciocalteu’s Phenol Reagent – Merck – 1.09001.
Thuốc thử.
+ DOC 0,15%: Cân 150 mg DOC cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất tới vạch. Trộn đều bằng que khuấy. Bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 năm.
+ TCA 72%: Cân 72g TCA cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch. Trộn đều bằng que khuấy. Bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 năm.
+ SDS 10%: Cân 10g SDS, thêm nước cất vừa đủ 100ml. Trộn đều bằng que khuấy. Bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 năm.
+ NaOH 0,8N: Cân 3,2g NaOH, thêm nước cất vừa đủ 100ml. Trộn đều bằng que khuấy. Bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 năm.
+ Thuốc thử CTC: Chuẩn bị 2 dung dịch: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch 1: Cân 5g sodium carbonate, thêm nước cất vừa đủ 25ml. Trộn đều bằng que khuấy.
Dung dịch 2: Cân 50mg CuSO4 và 100mg K-Na tartrate, thêm nước cất vừa đủ 25ml. Trộn đều bằng que khuấy.
Cho dung dịch 1 và dung dịch 2 vào bình định mức 50ml, lắc đều. Dùng giấy bạc bọc kín, bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 2 tháng.
+ Thuốc thử A: Trộn CTC, NaOH 0,8N, nước cất , SDS theo tỷ lệ 1:1:1:1. Chỉ pha khi dùng. Lưu ý thêm SDS vào thuốc thử sau cùng để tránh bị kết tủa. Dung dịch có màu xanh da trời.
+ Thuốc thử B: Pha loãng thuốc thử Folin Ciocalteu’s Phenol với nước cất tỷ lệ 1:6. Dung dịch có màu vàng chanh. Chỉ pha khi dùng. Bảo quản tối đa 1 ngày.
Dung dịch chuẩn.
+ Bovine Serum Albumin 2mg/ml (BSA 2mg/ml):
Từ chai chuẩn 1,47mg/ml: Thay vì cho 20ml như hướng dẫn để được 1,47mg/ml ta cho 14,7ml nước cất vào chai để được dung dịch 2mg/ml.
Từ albumin, Bovine: Cân 0,1g trong bình định mức 100ml, thêm từ từ nước cất vừa đủ. Đậy nút, lắc kỹ cho đều. (BSA 1mg/ml)
+ Albumin Standard 0,25mg/ml: Pha loãng 4 lần dung dịch BSA 1mg/ml hoặc 8 lần dung dịch BSA 2mg/ml (12,5ml/BĐM 100ml).
+ Mẫu đối chiếu: Mẫu thành phẩm có hàm lượng protein đã biết. Hàm lượng của mẫu này phải được xác định mỗi khi phân tích mẫu thử và so sánh với kết quả ban đầu (sử dụng Sheward chart).
c. Thực hiện.
Tiến hành thí nghiệm trong phòng vô trùng với các mẫu: Siêu ly tâm, sau lọc trong và gặt. Ở mỗi độ pha và đường chuẩn đều phải làm song song 2 ống nghiệm. Mẫu vacxin cúm cần được pha loãng với các độ pha loãng thích hợp. Cho vào ống nghiệm chính xác 100l BSA 10mg/ml, thêm tiếp 3900l nước cất. Sau đó lắc đều ống nghiệm ta sẽđược dung dịch BSA 0,25mg/ml.
Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị 6 ống nghiệm, cho lần lượt 0; 80; 160; 240; 320; 400 l BSA 0,25mg/ml và thêm nước cất vào các ống nghiệm vừa đủ 1000l.
Cho vào tất cả các ống chứa mẫu và đường chuẩn 100l DOC 0,15%, lắc đều, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho tiếp 100l TCA 72% vào các ống nghiệm trên, lắc đều rồi đem đi ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 30 phút. Ly tâm xong thì loại bỏ phần dung dịch, tách kết tủa rồi để khô tự nhiên. Cho tiếp vào các ống nghiệm 1000l nước cất. Sau đó thêm vào mỗi ống nghiệm 1000l dung dịch thuốc thử A. Lắc đều để hòa tan kết tủa hoàn toàn, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục cho vào mỗi ống nghiệm 500l dung dịch thuốc thử B. Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng. Lúc này dung dịch có màu xanh da trời, đo quang ở bước sóng λ = 750nm.
d. Tính kết quả.
Kết quả thí nghiệm được chấp nhận khi thỏa mãn các điều kiện sau:
Nồng độ protein của mẫu đối chiếu phải nằm trong giới hạn xác định của đồ thị Sheward chart (±2SD)
OD của cả 2 độ pha của mẫu thử phải nằm trong đường chuẩn.
Độ lệch chuẩn (CV) của phép đo trên mẫu thử < 10%.
2.3.2. Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang với thuốc thử acetylaceton.
a. Nguyên tắc.
Định lượng formaldehyde bằng cách đo cường độ màu của 3,5 diacetyl.1,4 dihydrothydin ở bước sóng 410 nm. Phức hợp này có màu vàng chanh được tạo thành do phản ứng của formaldehyde tự do trong mẫu kiểm tra với acetylaceton trong môi trường axit yếu.
b. Hóa chất, thuốc thử và dung dịch chuẩn.
Hóa chất:
+ Acetylaceton C5H8O2 – 1.09600 – Merck – Đức. + Amoniacetat CH3COONH4 – 1.00063 – Merck – Đức. + Acid acetic CH3COOH – 1.00063 – Merck – Đức. + Formaldehyde 37% HCHO – 1.04002 – Merck – Đức. + Pha dung dịch acetylaceton (đệm acetat pH 6.0)
Amoniacetat : 150g. Glacial acid acetic : 3ml. Acetylaceton : 2ml. Nước cất vừa đủ 1000ml.
Dung dịch có pH = 6, chỉnh pH bằng acid acetic hoặc amoniac, bảo quản ở 40C, sử dụng trong vòng 1 tuần.
Dung dịch chuẩn.
+ Pha dung dịch chuẩn formaldehyde 2mg/ml: Pha từ formaldehyde nguyên liệu đã được kiểm tra hàm lượng chính xác bằng phương pháp chuẩn độ iod: Cân chính xác khoảng 1g chế phẩm cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch. Hút 5ml dung dịch cho vào bình tam giác nút mài. Thêm 20ml dung dịch iod 0,1N và 10ml dung dịch NaOH 1N. Lắc, để yên ở chỗ tối 10 phút. Thêm 11ml dung dịch H2SO4 1N và định lượng iod được giải phóng bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi mất màu chỉ thị hồ tinh bột. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1ml dung dịch iod 0,1N tương ứng với 0,00151g HCHO. 36% ≤ hàm lượng formaldehyde trong dung dịch ≤ 40%.
+ Pha dung dịch chuẩn formaldehyde làm việc 2g/ml: Pha loãng dung dịch mẹ 1000 lần. Lấy 1ml dung dịch mẹ cho vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều.
Dung dịch chỉ dùng trong ngày.
c. Thực hiện.
Dung dịch mẫu và đường chuẩn phải làm song song 2 ống nghiệm. Cho vào các ống nghiệm chính xác 1ml dung dịch mẫu thử rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml nước cất.
Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị 6 ống nghiệm, cho lần lượt vào các ống nghiệm chính xác 0; 0.4; 0.8; 1.2; 1.6; 2.0ml dung dịch chuẩn formaldehyde 2g/ml. Lúc này hàm lượng formaldehyde tương ứng trong mỗi ống nghiệm là 0; 0.8; 1.6; 2.4; 3.2; 4.0 g. Tiếp theo là thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm vừa đủ 2ml. Sau đó, thêm vào mỗi ống nghiệm 2ml dung dịch đệm acetate (pH=6). Cho các ống nghiệm vào nồi cách thủy ở 600C trong 10 phút. Dung dịch sẽ có màu vàng chanh. Sau đó lấy ra và để nguội tới nhiệt độ phòng rồi đem đo quang ở bước sóng 410 nm.
d. Tính kết quả:
Dựng đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn này để tính nồng độ formaldehyde có trong mẫu kiểm tra.
X (%) formaldehyde = a*100/1000000 = a/10000
Trong đó: a =số g formaldehyde của mẫu tính theo đường chuẩn. 100: tính ra %.
2.3.3. Bán định lượng sucrose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. a. Nguyên tắc.
Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) là kỹ thuật tách sucrose từ một hỗn hợp các chất. TLC được tiến hành trên bản có tráng một lớp mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh) trên đó chấm hỗn hợp các chất cần tách. Dung môi (pha động) di chuyển lên phía trên bản mỏng theo cơ chế mao dẫn. Sucrose được tách ra do đặc tính khác nhau của các thành phần mẫu. Trên sắc ký đồ, cường độ vệt mẫu hình thành trên bản mỏng tương ứng với nồng độ sucrose.
b. Hóa chất, dung dịch đệm và thuốc thử.
Hóa chất.
+ Ethanol (96%) – excipient (dược) – Merck – 1.00986. + Acetone – Extra pure – Merck – 1.00013.
+ Ethylacetate Lichrosolv – Merck – 1.00868. + Thymol – min 99.5% - Sigma – T0501. + Sulphuric acid – p.a. – Merck – 1.00731. + Methanol Lichrosolv – Merck – 1.06018.
+ Sucrose (for density gradient ultracentrifugation) – Merck – 1.07654. + Boric acid – p.a. – Merck – 1.00063.
+ Glacial acetic acid – p.a. – Merck – 1.00063. + Nước cất 2 lần.
Dung dịch đệm và thuốc thử.
+ Đệm phosphate 0,01M pH 7,2 (PBS): Hòa tan 9,0g sodiumchloride (NaCl), 1,37g disodiumhydrogenphosphate dehydrate (Na2HPO4.2H2O), 0,32g sodiumdihydrogenphosphate monohydrate (NaH2PO4.H2O), trong vừa đủ 1 lít nước cất. Hấp tiệt trùng 1210C/20 phút. Bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 năm.
+ Dung dịch PBS/methanol (tỷ lệ 2:3): Hút 40ml PBS cho vào bình định mức 100ml, thêm methanol đến vạch. Pha khi dùng.
+ Dung dịch axit boric lạnh bão hòa: Cân 3g axit boric (H3BO3) cho vào bình thủy tinh có nắp đậy kín,thêm 50ml nước cất, khuấy khoảng 10 phút. Giữ trong tủ lạnh ít nhất 2 giờ. Bảo quản ở 40C tối đa 6 tháng.
+ Dung dịch thymol: Hòa tan 0,5g thymol trong 5ml axit sunfuric và 95ml ethanol 96%. Bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 năm.
+ Dung dịch axit acetic 60%(v/v): Thêm 9ml axit acetic băng vào 6ml nước cất. Pha khi dùng.
Dung dịch chuẩn:
+ Dung dịch chuẩn làm việc sucrose: Cân 1,25g sucrose cho vào bình định mức 50ml. Làm đầy đến vạch bằng dung dịch PBS/methanol (tỷ lệ 2:3). Lắc kỹ. Chỉ pha khi dùng.
+ Dung dịch chuẩn sucrose 100mg/l: Hút 20l dung dịch chuẩn làm việc sucrose. Thêm PBS/methanol đủ 5ml.
+ Dung dịch chuẩn sucrose 300mg/l: Hút 60l dung dịch chuẩn làm việc sucrose. Thêm PBS/methanol đủ 5ml.
+ Dung dịch chuẩn sucrose 500mg/l: Hút 100l dung dịch chuẩn làm việc sucrose. Thêm PBS/methanol đủ 5ml.
* Toàn bộ quá trình tiến hành đều thực hiện trong hốt (tủ hút khí độc) và mang găng tay thích hợp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c. Thực hiện.
Dùng bút chì đánh dấu trên bản mỏng đường xuất phát cách mép dưới của bản mỏng 3cm và đường kết thúc cách mép dưới của bản mỏng 18cm. Như vậy khoảng khai triển là 15cm. Đánh dấu các vị trí chấm mẫu và ghi ký hiệu mẫu. Khoảng cách giữa các vết chấm phải cách nhau ít nhất 2cm.
Cho vào ống nghiệm chính xác 20l dung dịch chuẩn làm việc sucrose, thêm PBS/ methanol đủ 5ml, lắc đều. Chấm 2l dung dịch vào vị trí thứ nhất đã đánh dấu trên bản mỏng. Hút 60l dung dịch chuẩn làm việc sucrose cho vào ống nghiệm, thêm PBS/ methanol đủ 5ml, lắc đều. Chấm 2l dung dịch vào vị trí thứ hai đã đánh
dấu trên bản mỏng. Hút 100l dung dịch chuẩn làm việc sucrose cho vào ống nghiệm, thêm PBS/ methanol đủ 5ml, lắc đều. Chấm 2l dung dịch vào vị trí thứ ba đã đánh dấu trên bản mỏng. Mẫu vacxin cúm A/H1N1 được pha loãng ở độ pha loãng thích hợp rồi chấm 2l vào các vị trí còn lại. Sau khi chấm dung dịch chuẩn và mẫu vacxin xong thì dùng máy sấy để sấy khô bản mỏng.
Tiếp theo là chuẩn bị pha động trong bình khai triển. Cho vào bình khai triển lần lượt 10ml dung dịch axit boric lạnh bão hòa, 15ml dung dịch axit acetic 60%, 60ml acetone, 60ml ethylacetate và khuấy đều. Đặt bản mỏng đã được sấy khô vào bình khai triển và đậy nắp kín. Đợi cho dung môi triển khai trên bản mỏng được một đoạn 15cm (thường khoảng 75 phút đến 90 phút), rồi lấy bản mỏng ra đặt trên tấm giấy lọc và sấy khô. Phun đều dung dịch thymol lên bản mỏng và để vào tủ sấy ở 1300C trong 10 phút. Sau đó lấy bản mỏng ra, kiểm tra sắc ký đồ có đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng không. Coppy hoặc scan bản mỏng bằng thiết bị có đủ độ nét.
d. Tính kết quả.
Kết quả thí nghiệm được chấp nhận khi thỏa mãn các điều kiện sau:
+ Trên sắc ký đồ vết mẫu thử có vị trí và kích thước tương ứng với các vết mẫu chuẩn. Rr= a/c (= 1), trong đó:
a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử. c: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chất chuẩn.
+ Các vết mẫu chuẩn có cường độ (màu) tăng dần tương ứng với nồng độ tăng dần. + Nồng độ đường trong mẫu thử (mg/ml) = nồng độ mẫu đo được x 2,5 (độ pha loãng).
+ Nếu cường độ vết mẫu không quan sát thấy hoặc bằng với chuẩn 100mg/l, ghi kết quả là: ≤ 250mg/l.
+ Nếu cường độ vết mẫu cao hơn chuẩn 100mg/l, có thể ước lượng nồng độ của mẫu thử so sánh với các chuẩn (100, 300, 500mg/l). Chuẩn bị 2 độ pha trong PBS/methanol sao cho có ít nhất một độ pha thấp hơn 100mg/l được dùng để tính kết quả, kết quả sẽ ghi >250mg/l và ≤ kết quả vừa tính.
Ví dụ: nồng độ mẫu thử nằm trong khoảng 300 và 500 mg/l, chuẩn bị 2 độ pha 1/ 4 và 1/5. Nếu cường độ vết của mẫu thử độ pha 1/5 thấp hơn chuẩn 100mg/l, kết quả sẽ ghi: >250mg/l và ≤ 500mg/l.
2.3.4. Thiết kế thực nghiệm và tiêu chuẩn đánh giá các thông số cần thẩm định của phương pháp phân tích.
Để đánh giá độ đúng, độ chính xác, độ đặc hiệu của các phương pháp phân tích định lượng cần tính các chỉ số sau:
- Độ lệch chuẩn SD (Standard Deviation) đặc trưng cho độ chính xác của phép đo, cho biết mức độ sát gần của các giá trị đo được xi với giá trị trung bình x
SD = ) 1 ( ) ( 2 n x x i
Trong đó: x là giá trị trung bình; xi là giá trị của 1 lần thực hiện; n là số lần thực hiện.
- Hệ số biến thiên CV (coefficient of variation) còn gọi là độ lệch chuẩn tương đối,dùng để đánh giá độ phân tán của dãy giá trị đo so với giá trị trung bình, để so sánh độ chính xác của các dãy giá trị đo.
CV (%) =
x SD
.100%
Bán định lượng sucrose bằng phương pháp TLC: Đánh giá độ nhạy của phương pháp với mẫu trắng và xem xét mức độ đáp ứng các điều kiện đã nêu trong phương pháp khi đánh giá kết quả.
Bảng 2.1: Bảng tóm tắt thẩm định thử nghiệm kiểm tra hàm lượng X Các thông số