* Chuẩn bị đệm rửa Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng Tris-HCl 1M, pH=8.0 0.1M NaCl 5M 1.4M EDTA 0.5M 0.02M PVP 2% H2O (khử ion)
*Chuẩn bị đệm chiết:
Solution/Reagent Nồng độ cuối Stock 100ml Buffer EB
CTAB 2% 2g PVP 2% 2g NaCl 1.4M 6M 23 ml EDTA, pH8 20mM 0.5M, pH8 4 ml Tris HCl, pH8 100mM 1M, pH8 10 ml *Các bước tiến hành:
1. Cân 200 - 500mg mẫu nghiền nhanh trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ
cho đến khi thành dạng bột mịn. Cho mẫu vào các ống eppendorf.
2. Bổ sung 800μl đệm rửa, đảo đều rồi đem ly tâm 12000v/phút trong 5
phút, thu cặn.
3. Lặp lại bước rửa thệm một lần nữa, thu cặn.
4. Bổ sung thêm 800 μl dung dịch đệm tách chiết DNA, trộn đề bằng cách
đảo ngược nhẹ. Tiếp tục bổ sung 2 μl Mecaptoethanol vào mỗi ống rồi đem vortex.
5. Ủ ở nhiệt độ 65oC trong 2-3 tiếng ( cứ 15 phút đảo nhẹ một lần) (thời
gian ủ càng lâu pellet càng sạch.
6. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, thu dịch nổi.
7. Bổ sung 800 μl Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), lắc đảo trong 15
phút và ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút.
8. Chuyển pha trên sang ống epp 1.5ml mới. Tiếp tục bổ sung 75 μl NaCl
6M và bổ sung 2 lần thể tích Ethanol 100% để tủa DNA ở -20oC từ 30
phút đến 1h.
9. Quan sát hỗn hợp dung dịch sau ủ, dùng tăm loại bỏ các đám tủa trong
10.Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút thu DNA . Sau đó rửa pellet bằng ethanol 70% , ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu cặn.
11.DNA được làm khô trong 10 phút bằng vacuum sau đó được hòa tan
trong 300 μl nước khử ion 2 lần.
12.Bổ sung 3μl RNase 1mg/ml (working 0.01mg/ml) ủ trong 1h ở 37oC.
13.Chiết lại một lần nữa với dung dịch Chloroform : Isoamy (24:1) tỉ lệ 1:1.
Ly tâm thu dịch nổi rồi chuyển sang ống epp sạch.
14.Bổ sung 75 μl NaCl 6M (1:10=v/v) và bổ sung 2 lần thể tích Ethanol
100% để tủa DNA ở -20oC, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút
tại nhiệt độ 25-30o. Thu cặn.
15.Rửa lại cặn bằng 500μl ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5
phút, thu cặn.
16.Làm khô cặn bằng vacuum trong 10 phút, và hòa tan trong 20-30μl nước
đề ion.
17.Kiểm tra DNA tổng số bằng cách chạy điện di 0.8% agarose gel. Bảo
quản mẫu ở -20oC.
2.3.2 Phương pháp PCR
- Phản ứng PCR cho tất cả các cặp mồi được thực hiện với các thành phần phản ứng thay đổi như trong bảng 1.
Bảng 2.2 Các công thức kết hợp sự thay đổi thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3 Công thức 4 Công thức 5 Primer F and R (100pM) 0,2 µl 0,2 µl 0,3 µl 0,3 µl 0,5 µl DNA (25ng/ µl) 1 µl 2 µl 1 µl 2 µl 2 µl MgCl2 (25mM) 1 µl 2 µl 1,5 µl 2 µl 2 µl dNTPs (5mM) 0,1 µl 0,2 µl 0,2 µl 0,1 µl 0,2 µl
- Chương trình Touch down PCR bao gồm các bước: 94oC trong 2 phút, 30 chu kỳ với 940C trong 45 giây, nhiệt độ gắn mồi thay đổi (65-550C/ 60-550 /55-450C) trong 1 phút, 720C trong 1 phút và thời gian kéo dài 10 phút ở 720C.
2.3.3 Phương pháp điện di trên gel Agarose - Thành phần 100ml gel Agarose 0,8%:
0,8 gram Agarose trong 100ml dung dịch đệm TBE 0,5X
5l ethidium bromide 10mg/ml
- 10X Dung dịch đệm TBE (Tris-Boric acid-EDTA):
108 gram Tris- base 55,2 gram Boric acid 40 ml 0,5M EDTA
Thêm nước khử ion cho đủ 1 lít
- 5X Loading buffer (cho 100ml)
0,16 gram Bromophenol Blue 0,16 gram Xylen Cyanol FF 50% ( v/v) Glycerol
thêm nước cho đủ 100 ml
*. Chuẩn bị gel Agarose 0,8%:
1. Cân 0,8g agarose, đong 100 ml TBE 0.5X cho vào bình tam giác.
2. Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất (1-2 min).
3. Để nguội đến khoảng 50 - 60oC, thêm 5l ethidium bromide và lắc đều.
4. Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không để lại bọt khí. Để gel đông lại trong khoảng 45 - 60 phút.
*. Điện di sản phẩm ADN được tách chiết:
1. Lắp đặt gel đã chuẩn bị vào bể điện di
3. Nạp mẫu ADN vào các giếng trên gel ( 2 - 3l ADN + 1l 5X Loading buffer)
4. Chạy điện di điện thế 100 - 125V và 100 mA trong thời gian 15 - 30 phút.
Chú ý: Thời gian chạy và điện thế sử dụng tuỳ thuộc vào kích thước gel và yêu
cầu của nghiên cứu. Để kiểm tra và đánh giá nồng độ và chất lượng ADN chỉ cần chạy để cho mẫu ra khỏi giếng 3 -5 cm là đủ.
5. Soi gel và đọc gel dưới ánh sáng UV. Ghi kết quả, chụp ảnh hoặc lưu ảnh qua máy tính.
*. Đánh giá chất lượng, nồng độ ADN tách chiết + Phương pháp so sánh bằng mắt thường:
Đánh giá chất lượng:
Trên gel Agarose dưới ánh sáng UV các băng ADN được nhận biết dưới dạng băng sáng. Nếu băng đó gọn thì là ADN chất lượng tốt, không bị gẫy. Nếu băng đó không gọn và phía trên theo chiều dịên di (từ giếng đi ra) có tạo thành dải kéo dài là chất lượng ADN không tốt, bị gẫy, không sử dụng được cho các nghiên cứu tiếp theo.
Đánh giá nồng độ
Nồng độ ADN được đánh giá bằng cách so sánh độ đậm, sáng của băng ADN với băng ADN chuẩn đã biết trước nồng độ:
Khi điện di ADN cần đánh giá ta đồng thời điện di ADN chuẩn đã biết trước
nồng độ (thường là -DNA chuẩn) trên cùng một gel. Sau đó so sánh bằng mắt
các băng ADN của mẫu với băng -DNA để xác định nồng độ. Phương pháp
này tuy không thật chính xác, song đối với các thí nghiệm không đòi hỏi độ chính xác cao nồng độ ADN ta có thể ứng dụng.
+ Phương pháp quang phổ kế
Đánh giá nồng độ:
Phương pháp đánh giá bằng cách đo mật độ quang học trên quang phổ kế (Chi tiết phương pháp xem thêm môn học vật lý, hoá lý).
Để xác định nồng độ và chất lương ADN người ta tiến hành đo mật độ quang học của ADN ở các bước sóng 260 nm và 280 nm, sau đó vận dụng công thức để tính toán. Phương pháp này cho ta giá trị chính xác, trong một số thí nghiệm đòi hỏi độ chính xác cao ta phải dùng phương pháp này.
CADN = OD 260 X số lần pha loãng X 50 g / ml CADN : Nồng độ ADN của mẫu
OD260 : Giá trị mật độ quang học đo được ở bước sóng 260 nm
Số lần pha loãng mẫu: 1ml / thể tích dịch ADN đưa pha loãng trong 1 ml ( pha loãng bằng TE).
50 g /ml : Nồng độ chuẩn khi đo dịch chuẩn ở bước sóng 260 nm có giá trị
OD = 1,0
Đánh giá chất lượng ADN:
Tính tỷ số OD mẫu260 / OD mẫu 280
nếu tỷ số này > 1,7 - chất lượng ADN sạch nếu tỷ số này < 1,7 - chất lượng không sạch
Cách đánh giá này không cho biết là ADN có bị gẫy hay không. Để kiểm tra vẫn phải chạy điện di trên gel Agarose.
2.3.4 Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide *. Chuẩn bị kính *. Chuẩn bị kính
1 - Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.
2 - Lau tấm kính ngắn với giấy lụa tẩm Rain X.
3 - Lau tấm kính dài với dung dịch tạo liên kết (Binding solution: 2l Binding Silane, 1ml 95% ethanol, 5% glacial acetic acid), để 5 phút cho kính khô.
4 - Lau tiếp tấm kính dài bằng ethanol 95% 3 lần, mỗi lần sau 5 phút. 5 - Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4 mm.
*. Chuẩn bị gel polyacrylamide
1. Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1= acrylamide: bisacrylamide).
- Dung dịch gốc (40% Acrylamide)
Thể tích cần pha 500 ml 1000ml
Acrylamide 190g 380g
Bis- acrylamide 10g 20g
H2O khử ion cho đủ 500 ml cho đủ 1000 ml
- Dung dịch làm việc (4,5% acrylamide)
Dung dịch gốc Nồng độ cuối cùng Lượng cần cho gel 500ml
40%acrylamide 4,5% 56,25ml
Urea 42% 210g
5X TBE 1X 100ml
H2O khử ion cho đủ 500 ml
2. Đổ 60 ml dung dịch làm việc vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 600 l ammonium
persulfate (APS 10%) và 60l TEMED, trộn đều .
3. Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí.
4. Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài). Dùng kẹp cố định lược.
5. Để gel polymer hoá trong 2 giờ.
*. Điện di trên gel polyacrylamide biến tính
1. Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. 2. Lắp ráp bộ điện di. Pha 1lit đệm TBE X1 vào buồng đệm trên và dưới. 3. Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50-60A, điện thế là 92- 100W.
4. Trộn sản phẩm PCR với 8l Sequencing stop solution (10mM NaOH; 95%
formamide; 0,05% bromophenol blue; 0.05% xylene cyanol).
5. Biến tính các sản phẩm PCR và chỉ thị trọng lượng phân tử (molecular weight
marker) ở 95oC trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên
6. Tra vào mỗi giếng 6l sản phẩm PCR đã được làm biến tính, giếng đầu tiên cho 6l chỉ thị trọng lượng phân tử .
7. Tiến hành điện di với điện thế 60W và ở 50oC, thời gian khoảng 60-90 phút.
* Nhuộm gel theo phương pháp nhuộm bạc
1. Chuẩn bị các dung dịch:
- Dung dịch Cố định/Dừng phản ứng: 10% glacial acetic acid.
- Dung dịch Nhuộm: 1% AgNO3, sau đó bổ sung thêm 1,5ml forrmaldehyde 37%/1 lít dung dịch.
- Dung dịch Hiện băng: 30% natri cacbonat (NaCO3) và làm lạnh ở -20oC. Khi
sử dụng cho thêm 1,5ml formaldehyde 37% và 200l natri thiosulfate/1lít dung
dịch.
2. Các bước tiến hành:
- Sau khi chạy điện di, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau đây. - Cố định gel: đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ
dung dịch Cố định/Dừng phản ứng vào và lắc nhẹ trong 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch, chú ý giữ lại dung dịch này để dùng cho bước sau.
- Rửa gel: đổ 1lít nước cất vào khay đựng tấm kính bám gel, lắc nhẹ trong 5 phút. Bước này lặp lại 2 lần.
- Nhuộm gel: cho gel vào 1 lít dung dịch Nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút.
- Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nước cất trong 5 giây.
- Đưa gel vào dung dịch hiện băng và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện.
- Cho gel vào dung dịch Cố định/Dừng phản ứng ở trên trong 3-6 phút.
- Rửa lại gel bằng nước cất.
- Để khô gel ở nhiệt độ phòng. - Đọc kết quả và sao chụp dữ liệu.
2.3.5 Xử lý số liệu
* Độ chính xác và chất lượng của băng ADN được ghi nhận theo phương pháp của Smulders và ctv: trong đó điểm chất lượng từ 1-3 là những băng nhân bản tốt. 1 = Bên cạnh băng chính, băng lặp lại rất mờ hoặc không có; 2 = Băng lặp lại rõ hơn nhưng có thể ghi lại số liệu dễ dàng; 3 = Xuất hiện băng có kích thước không mong muốn nhưng vẫn dễ dàng ghi lại số liệu; 4 = Xuất hiện
băng có kích thước không mong muốn và không ghi lại số liệu được; 5 = Thang chuẩn có băng không đúng nhưng vẫn có thể ghi lại số liệu; 6 = Thang chuẩn cho băng rõ nhưng không ghi số liệu được; 7 = Băng rất mờ hoặc không nhân bản. Chỉ những mồi có điểm từ 1-3 mới được chọn cho đánh giá tiếp theo. Số liệu được ghi nhận băng có mặt là (1) và vắng mặt là (0).
* Số liệu ADN được tính toán theo chương trình NTSYS PC 2.1
+ Hệ số tương đồng di truyền theo công thức củaNei và Li (1979) trong chương
trình NTSYS PC 2.1, trong đó:
Sij= Sij= 2a/(2a+b+c), vớiSij: Độ tương đồng giữa hai mẫu i và j
Các giá trị chung khác giữa hai công thức: aij là số băng có mặt ở cả hai mẫu i và j,
bij là số băng có mặt ở mẫu i nhưng không có ở mẫu j cij là số băng có mặt ở mẫu j nhưng không có ở mẫu i.
Ma trận tương đồng được tính toán theo phương pháp UPGMA (Unweighted
Pair Group Method with Arithmetic mean)
- Hệ số đa dạng gen hay giá trị thông tin đa hình giữa các marker (PIC, Polymorphism Information Content) được tính toán theo Weir [162]:
PIC = 1-Pij2
Phương pháp lai tạo trong nhà lưới
Sơ đồ chọn giống kháng bệnh đốm muộn bằng chỉ thị phân tử
* Phương pháp khử đực:
Để ngăn ngừa sự tự thụ phân phải khử đực trên toàn bộ các cây mẹ trước khi tung phấn,. Thời điểm khử đực thường các nụ hoa từ chùm hoa thứ 1 được chọn để khử đực vì những hoa đợt đầu này có khả năng đậu quả cao , những hoa có cánh hoa hé ra khỏi nụ nhưng chưa mở, màu của tràng hoa hơi vàng ngay cả màu vàng nhạt. Khử đực từ 2-4 giờ chiều vì lúc này hạt phấn đã bắt đầu chín nhưng chưa bị tung phấn. Dụng cụ khử đực như panh, kéo, gang tay đều được khử trùng trước khi khử đực bằng cồn 95% để tránh nhiễm phấn. Sử dụng điểm nhọn, sắc của panh để mở nụ hoa khử đực, sau đó mở nón bao phấn. Thận trọng lấy nón phấn ra ngoài nụ để lại nguyên đài, tràng và cánh hoa, chú ý không được làm vỡ bao phấn trong quá trình khử đực. Sau khi khử đực một
đực nhanh, chính xác là yêu cầu trong sản xuất hạt lai vì nếu chậm tốn công lao động giá thành hạt lai cao. Nếu thao tác không chính xác khử đực không triệt để, vỡ bao phấn dẫn đến tạo ra hạt tự thụ mà không phải là hạt lai. Những hoa không được khử đực đẻ lai thì nên ngắt bỏ để tập trung dinh dưỡng cho hoa đã được lai và hạn chế nhầm lẫn. Để nhận biết quả lai với quả tự thụ phấn tại thời điểm lai nên buộc thẻ ghi ngày tháng để đánh dấu. Khi thu hoạch chỉ thu những quả có đánh dấu mới là quả lai.
*Phương pháp lấy phấn và thụ phấn:
Nên lấy phấn từ cây bố trước 1ngày, khi đó hạt phấn đủ chín thì cho tỷ lệ đậu quả cao nhất. Hạt phấn lấy được bảo quản trong đĩa petri, đặt trong tủ lạnh. Nên thụ phấn vào buổi sáng (từ 8 giờ - đến 11giờ) sáng hôm sau. lấy hạt phấn của cây bố để vào đầu nhụy của cây mẹ.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập, đánh giá, xây dựng nguồn vật liêu
3.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm hạt của các giống mẫu
Qua điều tra thu thập chúng tôi có được một tập đoàn lạc gồm 64 mẫu giống. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát đánh giá các mẫu giống. Kết quả bảng 2 cho thấy trong tập đoàn 67,2% là giống địa phương, 32,8% là các giống lạc nhập nội.
Bảng 3.1. Nguồn gốc và đặc điểm hạt các mẫu giống
Màu sắc hạt của các giống trong tập đoàn là phong phú, đa số các giống có hạt màu hồng (83,4%) còn lại là các hạt màu đỏ, màu tím, màu trắng.
3.1.2 Các chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của lạc * Các chỉ tiêu về thân cành * Các chỉ tiêu về thân cành
Nghiên cứu mô tả, đánh giá các chỉ tiêu (các tính trạng) về hình thái : thân và cành, kết quả bảng 3.2 cho thấy: Các mẫu giống có kiểu cây bò lan với thân chính đứng.
Số mẫu giống Nguồn gốc Tỉ lệ % Số mẫu giống Màu hạt Tỉ lệ %
64 64
3 Trắng 4,7
21 Nhập nội 32,8 54 Hồng 83,4
43 Địa phương 67,2 4 Đỏ 6,2
Bảng 3.2. Sự phân bố của các mẫu giống theo các tính trạng về thân cành