2. Mục tiêu nghiên cứu
3.2.1.Đặc điểm đoạn gen matK
Sau khi tách chiết DNA tổng số và kiểm tra độ tinh sạch, thí nghiệm nhân bản đoạn gen matK từ DNA hệ gen bằng PCR với cặp mồi matK-F / matK-R
(bảng 2.1) được thực hiện. Kết quả kiểm tra phản ứng PCR bằng điện di trên gel agarose 1 % thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 800 bp như đã dự kiến (Hình 3.6).
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn
(A: marker 1kb, B sản phẩm PCR của mẫu nghiên cứu)
Gen matK của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn được tinh sạch và xác định trình tự trực tiếp trên máy tự động. Sử dụng phần mềm BLAST trên NCBI để so sánh sự tương đồng về trình tự nucleotide và định danh gen phân lập được, kết quả BLAST được trình bày ở hình 3.7
Hình 3.7. Kết quả phân tích gen matK bằng BLAST trong NCBI
Theo hình 3.7, đoạn gen matK của cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn được so sánh với 5 trình tự trên GenBank với độ tương đồng đều là 97,37 % . Kết quả so sánh sự tương đồng về trình tự nucleotide như vậy khẳng định trình tự mẫu nghiên cứu là trình tự đoạn matK thuộc chi Paris.
Sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích trình tự nucleotide đoạn bảo thủ của gen, chúng tôi thu được đoạn có chiều dài 772 nucleotide, được trình bày ở hình 3.8.
Dựa trên trình tự nucleotide của gen matK, bằng phần mềm DNAstar chúng tôi thiết lập bảng tỉ lệ tương đồng và tỉ lệ phân ly ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 trình bày về mức độ tương đồng và mức độ phân ly dựa trên trình tự nucleotide của gen matK. Theo đó, trình tự nucleotide của gen
matK của mẫu Bắc Sơn- Lạng Sơn có độ tương đồng với các loài thuộc chi
Paris từ 45,1 % đến 99,9 %. Loài có độ tương đồng lớn nhất với mẫu Bắc Sơn- Lạng Sơn đạt 99,9 % là Paris polyphylla var chinensis (mẫu có mã số trên Genbank KM242785).
Bảng 3.1. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn dựa trên trình tự đoạn gen matK
Mối quan hệ di truyền về trình tự nucleotide của gen matK thể hiện trên sơ đồ hình cây 3.9 theo phương pháp Neighbor-Joining trên phần mềm MEgAlign. Kết quả biểu diễn trên hình 3.9 cho thấy sự phân bố của gen matK của mẫu cây Bảy lá một hoa nằm trong cùng nhánh với Parispolyphylla var. chinensis (mẫu có mã số trên Genbank KM242785).
Nu cleo tid e Su bs titution s (x1 00 )
0 50 .2 10 20 30 40 50
KM24 278 7_ Paris_ po lyph ylla_ var._ sten op hy KM24 277 8_ Paris_ de la va yi
KM24 278 8_ Paris_ po lyph ylla_ var._ yu nn an en KR 23 327 2_ Paris_ farge sii
MK 48 808 5_ Paris_ nitida
KM24 278 5_ Paris_ po lyph ylla_ var._ ch inen si m a tK _Ba c_ So n
MF49 570 5_ Pa ris_ m arm o ra ta MF41 776 8_ Pa ris_ luq uan en sis KX78 40 50_ Pa ris _vie tnam ens is KX78 40 46_ Pa ris _m a irei KX78 40 45_ Pa ris _luq uan en sis KX78 40 41_ Pa ris _cro nqu istii
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên đoạn gen matK của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn