2. Mục tiêu nghiên cứu
3.2.2.Đặc điểm vùng gen ITS
Thí nghiệm nhân bản vùng gen ITS từ DNA hệ gen được thực hiện như mô tả ở mục 2.2.2 và kiểm tra trên gel agarose 1 % thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 800 bp như đã dự kiến (Hình 3.10).
Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn
(M: marker 1kb, 1,2, ký hiệu của mẫu nghiên cứu)
Vùng gen ITS của mẫu Bắc Sơn- Lạng Sơn được tinh sạch và xác định trình tự trực tiếp trên máy tự động. Sử dụng phần mềm BLAST trên NCBI thu được kết quả trình bày ở hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả phân tích bằng BLAST trình tự nucleotide vùng gen ITS
Theo hình 3.11, vùng gen ITS của cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn được so sánh với 15 trình tự trên GenBank với độ tương đồng đều là 98,34% đến 98,94%. Kết quả so sánh sự tương đồng về trình tự nucleotide như vậy khẳng định trình tự mẫu nghiên cứu là trình tự đoạn ITS
thuộc chi Paris, trong đó độ tương đồng lớn nhất với mẫu Paris polyphylla
var. chinensis (mẫu có mã số trên Genbank KX146531) ở mức 98,94%.
Sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích trình tự nucleotide đoạn bảo thủ của gen, chúng tôi thu được đoạn có chiều dài 661 nucleotide, được trình bày ở hình 3.12.
Hình 3.12. Trình tự vùng gen ITS của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn Dựa trên trình tự nucleotide của gen ITS, bằng phần mềm DNAstar chúng tôi thiết lập bảng tỉ lệ tương đồng và tỉ lệ phân ly (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn dựa trên trình tự vùng gen ITS
Theo kết quả bảng 3.2, trình tự nucleotide của vùng gen ITS của mẫu Bắc Sơn- Lạng Sơn có độ tương đồng với các loài thuộc chi Paris rất cao, từ 98,3% đến 98,9%. Loài có độ tương đồng lớn nhất với mẫu Bắc Sơn- Lạng Sơn đạt 98,9% là Paris polyphylla var chinensis (KX146530).
Nucleotide Subs titutions (x100)
0 254 .0 50 100 150 200 250
MK350 325_Paris _delavayi_va r._delava yi MK346 921_Paris _farg es ii_var._brevipe tal MH7110 38_Paris _farge s ii
MK350 326_Paris _polyp hylla _var._ps eud oth DQ6636 78_Paris _axialis
AY1 92025_ Paris _c ron quis tii MK309 858_Paris _nitida
KX14 6530_P aris _po lyphylla_va r._chinen s i ITS_Bac _Son
KX14 6531_P aris _po lyphylla_va r._chinen s i KX14 6539_P aris _po lyphylla_va r._polyp hyl
Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS của các mẫu nghiên cứu
Mối quan hệ di truyền về trình tự nucleotide của gen matK thể hiện trên sơ đồ hình 3.13. Kết quả biểu diễn trên hình 3.13 cho thấy sự phân bố của mẫu thu thấp tại Bắc Sơn nằm cùng nhánh nhỏ và gần nhất với hai mẫu
Paris polyphylla var chinensis (mẫu có mã số trên Genbank KX146531 và KX146530).
Kết hợp các đặc điểm nghiên cứu về hình thái, giải phẫu và trình tự nucleotide của đoạn gen matK, vùng gen ITS có thể nhận diện mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn là giống Parispolyphylla var chinensis.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. Kết luận
1. Về hình thái, giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn
1.1. Về mặt hình thái, cây có chiều cao thân chính 40 cm, lá hình soan ngược, chóp lá có mũi 1,5 cm. Đài hoa mẫu 5, hình mác. Tràng hoa màu vàng- xanh. Nhị hoa mẫu 16. Buồng trứng hình cầu, có 1 ngăn. Vòi nhụy ngắn, chân đế mở rộng, màu tím. Đầu nhụy sẻ thùy 5.
1.2. Về mặt giải phẫu, (i) Cuống lá có 3 phần biểu bì, mô mềm và một bó dẫn dạng hình cung- mặt lõm hướng lên trên; (ii) Thân cây có biểu bì ở ngoài cùng, bên trong gồm mô mềm và nhiều bó dẫn nằm rải rác; (iii) Rễ cây có phần vỏ và phần trung trụ, các bó dẫn của trung trụ xếp luân phiên tròn đều trong mô mềm. Cấu tạo giải phẫu của mẫu là điển hình của cây một lá mầm.
2. Về đặc điểm của gen matK, ITS của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn.
2.1. Đoạn gen matK được nhân lên có chiều dài 772 bp, độ tương đồng với 5 loài thuộc chi Paris ở mức 99,37%.
2.2. Vùng gen ITS có chiều dài 661 bp, độ tương đồng với 15 loài và dưới loài thuộc chi Paris từ 98,34 % đến 98,94%.
3. Kết hợp các đặc điểm nghiên cứu về hình thái, giải phẫu và trình tự nucleotide của đoạn gen matK, vùng gen ITS có thể nhận diện mẫu cây Bảy lá một hoa thu thấp tại Bắc Sơn - Lạng Sơn là giống Paris polyphylla var chinensis.
II. Kiến nghị
Nên sử dụng phương pháp phân loại thực vật bằng hình thái, giải phẫu, đoạn gen matK, vùng gen ITS để nhận diện các loài thuộc chi Paris.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
Hoàng Phú Hiệp, Trương Mạnh Tiến, Lương Thị Thúy Vân, Phạm Thị Thanh Vân, Nguyễn Thị Thu Hà, Vũ Thị Thu Thủy*, 2019, ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,
GIẢI PHẪU CỦA LOÀI Paris polyphylla var chinensis VÀ TÍNH CHẤT ĐẤT TRỒNG
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Lý Thị Bôn, Nguyễn Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Thu Ngà, Sỹ Danh Thường, 2017, Sử dụng mã vạch DNA trong việc định loại loài Hồng trâu (Capparis versicolor Griff.), Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VII: 62-66.
2. Lê Trần Chấn, Trần Ngọc Ninh, Trần Thị Thúy Vân, 2013, Đa dạng sinh học và giải pháp bảo vệ, phát triền bền vững vùng núi đá vôi ở tỉnh Hà Giang, Hội thảo khoa học và diễn đàn đầu tư “Vì Hà Giang phát triển”, 115-120.
3. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Quỳnh Nga, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Thị Thu, Ninh Thị Phíp, Đoàn Thị Thanh Nhàn, Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Nhật Linh, 2018, Đặc điểm hình thái và mã vạch DNA của loài cây Bảy lá một hoa, Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 16 (4), 282-289.
4. Nguyễn Thị Đỏ, 2007, Thực vật chí Việt Nam 8, Khoa học và kỹ thuật, 311-321. 5. Đỗ Văn Hài, Chang Young Lee, Hà Minh Tâm, 2017, Đặc điểm hình thái và
phân loại chi Bạch hạc - Rhinacanthus Nees (họ Ô rô Acanthaceae) ở Việt Nam, Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VII, 140-144.
6. Tạ Lê Mai Hậu, Phạm Văn Minh, Hà Vân Oanh, Chử Thị Thanh Huyền, Đào Thị Thanh Hiền, Đỗ Thị Hà, 2016, Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây phong lữ thảo (Pelargonium hortorum L. H. Bailey), Tạp chí Dược học, 56 (6), 73-76.
7. Phạm Hoàng Hộ, 1999, Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ Thành phố Hồ Chí Minh, 473-475.
8. Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong, 2015, Xác định đoạn mã vạch DNA cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis): Loài cây đặc hữu của Việt Nam, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 5: 123-130.
9. Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Quỳnh Nga, Phan Văn Trưởng, Hoàng Văn Toán, Nguyễn Xuân Nam, Phạm Thị Ngọc, Phạm Thị Vân Anh, 2015, Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu loài hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) ở Việt Nam, Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VI, 166-172.
10. Lê Thị Thanh Hương, Trần Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Ngọc Yến, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Nghĩa Thìn, 2012, Thực trạng các loài cây quý hiếm thu thập tại tỉnh Thái Nguyên, Tạp chí KHTN và CN - ĐHQGHN, 28: 173-194. 11. Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, 2014, Mối
quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng matK và ITS - rDNA, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12 (2), 327-337.
12. Đỗ Tất Lợi, 2004, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Y Học,
13. Nguyễn Thị Hồng Mai, Nguyễn Mạnh Cường, Ngũ Trường Nhân, Nguyễn Phương Đại Nguyên, Nguyễn Thị Phương Trang, 2017, Đặc điểm phân tử vùng gen rpoC của loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis Pierre) và Sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam và ứng dụng phân loại, Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VII, 814-817. 14. Chu Hoàng Mậu, Hoaàng Phú Hiệp, Nguyễn Hữu Quân, 2019, Giáo trình
Tin sinh học, Nxb: Đại học Thái Nguyên,
15. Nguyễn Kim Phụng, 2007, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, Nxb Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh,
16. Bùi Hồng Quang, Trần Thế Bách, Đỗ Văn Hài, Dương Thị Hoàn, Nguyễn Thị Thanh Hương, Lê Ngọc Hân, Trần Đức Bình, Doãn Hoàng Sơn, Vũ Anh Thương, Sangmi Eum, Vũ Tiến Chính, 2017, Bổ sung một loài thuộc
chi Ngân hoa - Silvianthus bracteatus Hook. f. Họ Cạt man (Carlemanniceae) ở Việt Nam, Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VII, 324-327.
17. Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga, 2008, Hình thái - Giải phẫu học Thực vật, Nxb Đại học Sư phạm.
18. Dương Văn Tăng, Nguyễn Quốc Bình, Đinh Thị Phòng, 2011, Trình tự nucleotide vùng ITS nhân và mối quan hệ di truyền của 3 loài gỗ quý Việt Nam: Trắc (Dalbergia cochinchinensis), Cẩm lai (Dalbergia oliveri) và Sưa (Dalbergia tonkinensis), Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật lần thứ VII, 1296-1300.
19. Nguyễn Thị Tần, 2013, Cây dược liệu - lợi thế để người dân vùng cao Lào Cai thoát nghèo, Tạp chí kinh tế kỹ thuật Lào Cai, 24: 590.
20. Nguyễn Tập, 2004, Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam, Viện dược liệu, 14-15. 21. Nguyễn Tập, 2007, Cẩm nang cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam, Mạng lưới
lâm sản ngoài gỗ Việt Nam, 49-50, 71-72.
22. Nguyễn Thị Thu, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Đắc Bình Minh, Đào Thùy Dương, Nguyễn Thị Duyên, 2016, Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam, Tạp chí Dược liệu, 21 (4), 242-247.
23. Vũ Thị Thu Thủy, 2017, Đặc điểm sinh học và giá trị dược học của cây Bảy lá một hoa thuộc chi Paris, Tạp chí khoa học & Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 171 (11), 49-54.
24. Vũ Thị Thu Thủy, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Thị Thu Ngà, Chu Hoàng Mậu, 2016, Đặc điểm của trình tự gen rpoC1 phân lập từ cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) thu tại Lạng Sơn, Việt Nam, Tạp chí khoa học & Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 168 (08), 165-168.
25. Vũ Thị Thu Thủy, Lục Văn Dương, Ngô Thùy Linh, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Thị Thu Ngà, Chu Hoàng Mậu, 2018, Một số đặc điểm hình thái,
giải phẫu và trình tự đoạn gen matK của mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập tại Lào Cai, Báo cáo Hội nghị CNSH toàn quốc 2018, Nxb KHTN và CN, 1665-1671.
26. Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Thu Ngà, Hoàng Phú Hiệp, Chu Hoàng Mậu, 2016, Sử dụng mã vạch DNA trong việc định loại loài cây dược liệu Thất diệp nhất chi hoa ở Việt Nam (Paris Polyphylla Sm.), Tạp chí khoa học & Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 171 (11), 49-54
27. Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Thu Ngà, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Thị Thúy Lan, Nông Lệ Thùy, Chu Hoàng Mậu, 2016, Sưu tập và phân tích đặc điểm trình tự đoạn gen rpoC1 của cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla
sm.), Kỷ yếu Hội thảo sinh viên và cán bộ trẻ các trường Sư phạm toàn quốc, Nxb ĐHSP Thành phố Hồ Chí Minh, 2016: 971-978.
28. Nông Thị Anh Thư, Nguyễn Quý Thái, Nguyễn Thị Minh Thúy, Đào Thanh Hoa, 2017, Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng giảm đau, chống viêm của dược liệu Sóng rắn thu hái tại Thái Nguyên, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 17 (6), 10-12.
29. Nguyễn Thị Phương Trang, Trần Thu Hương, Ludwig Triest, Nguyễn Minh Tâm, 2014, Đặc điểm di truyền ba loài Sao (Hopea) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 36 (3), 316-322.
30. Viện dược liệu, 2003, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb: Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 182-184.
II. Tài liệu tiếng Anh:
31. Chase MW, Salamin N, Wilkinson M, Dunwell JM, Kesanakurthi RP, Haider N, V. S, 2005, Land plants and DNA barcodes:Short-term and long- term goals, Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences, 360 1889-1895.
32. Gao T, Pang X H, Chen S L, 2009, Authentication of plants in Astragalus by DNA barcoding technique, Plant Med, 75 (9), PB21.
33. Havill, Nathan P., Campbell, Christopher S., Vining T F, LePage, Ben, Bayer, Randall J., Donoghue, Michael J., 2008, Phylogeny and Biogeography of Tsuga (Pinaceae) Inferred from Nuclear Ribosomal ITS and Chloroplast DNA Sequence Data, Systematic Botany, 478-479.
34. Hodkinson, Trevor R., Chase W, Lledo M, Dolores M., Salamin, Nicolas, Renvoize, Stephen A., 2002, Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnL intron and trnL-F intergenic spacers, Journal of Plant Research, 115 (5), 381-392. 35. John Kress W, Erickson D L, 2008, DNA barcodes: Genes, genomics, and
bioinformatics, Proc Natl Acad Sci USA, 105 (8), 2761-2762.
36. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, DH. J, 2005, Use of DNA barcodes to identify flowering plants, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 102 8369 – 8374.
37. Lahaye R, Bogarin D, Van der Bank M, Warner J, Pupulin F, Gigot G, Maurin O, Duthoit S, Barraclogh TG, 2008, DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2923 – 2928
38. Li F. R., Jiao P., Yao S. T., Sang H., Qin S. C., Zhang W., Zhang Y. B., Gao L. L., 2012, Paris polyphylla Smith extract induces apoptosis and activates cancer suppressor gene connexin 26 expression, Asian Pac J Cancer Prev, 13 (1), 205-209.
39. Li X, Wang B, Han R, Zheng Y, Yin H Y, Xu L, 2013, Identification of medicinal plant schisandra chinensis using a potential DNA barcode ITS2,
Acta Soc Bot Pol, 82 283-288.
40. Liang Songyun, Victor G. Soukup, 2000, Paris Linnaeus, Flora of China, 88-95.
41. Man S., Gao W., Zhang Y., Yan L., Ma C., Liu C., Huang L, 2009, Antitumor and antimetastatic activities of Rhizoma Paridis saponins,
Steroids, 74 (13:), 1051-1056.
42. Mohd Tariq, Shyamal K. Nandi, Indra D. Bhatt, 2016, Conservation planing of Paris polyphylla Smith an important medicinan Herb of the Indian Hymalayan region using predictive ditribution, International Scholary and Scientific rearch and innovation, 3 (9), 408.
43. Nguyen Quynh Nga, Pham Thanh Huyen, Phan Van Truong, Hoang Van Toan, 2016, Taxonomy of the genus Paris L.(Melanthiaceae) in Vietnam,
Tạp chí Sinh hoc, 38 (3), 333-339.
44. Paul DN Heberrt, Alina Cywinska, Shelley L. Ball, Jermy R. deWaard, 2003, Biological identications throught DNA barcodes, Proceeding Of The Royal Society, 313-321.
45. Pirie M, ichael D., Oliver, E. G. H., Bellstedt, Dirk U., 2011, A densely sampled ITS phylogeny of the Cape flagship genus Erica L. suggests numerous shifts in floral macro-morphology, Molecular Phylogenetics and Evolution, 61 (2), 593-601.
46. Savolainen V, Cowan RS, Vogler AP, Roderick GK, 2005, DNA barcoding of life, Phil Trans R Soc London Ser B, 1805–1811.
47. Savolainen V, Cowan RS, Vogler AP, Roderick GK, 2005, DNA barcoding of life, Phil Trans R Soc London Ser B, 1805–1811.
48. Scheunert, Agnes, Heubl, Gunther, 2014, Diversification of Scrophularia (Scrophulariaceae) in the Western Mediterranean and Macaronesia – Phylogenetic relationships, reticulate evolution and biogeographic patterns,
Molecular Phylogenetics and Evolution, 70 296-313.
49. Shen S, Chen D, Li X, Li T, Yuan M, Zhou Y, Ding C., 2014, Optimization of extraction process and antioxidant activity of polysaccharides from leaves of Paris polyphylla, Carbohydrate polymers, 104: 80-86.
50. Vijayan K, Tsoul C.H, 2010, DNA barcoding in plants: taxonomy in new perspective, Current Science, 99 (11), 1530-1538.
51. Vijayan K, Tsoul C.H, 2010, DNA barcoding in plants: taxonomy in new perspective, Current Science, 1530-1538.
52. Vu Thi Thu Thuy, Nguyen Thi Ngoc Lan, Dinh Thi Huyen, Hoang Phu Hiep, Tran Thi Hong, Nguyen Thi Thu Nga, Sy Danh Thuong, Nguyen Huu Quan, Mau C H, 2018, Identification of Paris species from Sa Pa and Puluong in Viet Nam using DNA barcodes, The 5th Academic Conference on Natural Science for Young Scientists, Master and PhD Students from Asean Countries, Publishing House for Science and Technology, 190-196. 53. Warwick, Suzanne I., Mummenhoff, Klaus, Sauder, Connie A., Koch,
Marcus A., Al-Shehbaz, Ihsan A., 2010, Closing the gaps: phylogenetic relationships in the Brassicaceae based on DNA sequence data of nuclear ribosomal ITS region, Plant Systematics and Evolution, 209-232.
54. Y Teerawatsakul, S Dheeranupattana, K Sringarm, 2014, Effect of temperature on shoot tip culture of Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) Hara,, Planta Med, 80 - P82O10. DOI: 10.1055/s-0034-1395004.
55. Yang, Tao, Zhang, Tian-lei, Guo, You-hao, Liu, Xing, 2016, Identification of hybrids in Potamogeton: Incongruence between plastid and ITS regions