VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình tự gen
Sản phẩm sau khi PCR s được tinh sạch và kiểm tra nồng độ bằng cách đo OD (định lượng DNA) sử dụng máy quang phổ thể tích nano, Nano Photometer- implen NP80 (quy trình giống với quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang ở mục 2.4.3.2). Tuỳ vào nồng độ của từng mẫu sau khi tinh sạch mà chúng tôi cô đặc hoặc pha loãng mẫu cho tới khi nồng độ DNA của mẫu lúc này đạt tới nồng độ 40 - 50 ng/µl để tiếp tục thực hiện phản ứng RFLP hoặc gửi giải trình tự mẫu.
2.4.8.1. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp RFLP
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, DNA s được cô đặc hoặc pha loãng cho đến nồng độ 40 - 50 ng/µl và tiến hành quy trình cắt bằng enzym cắt giới hạn.
Để đảm bảo phản ứng cắt xảy ra hoàn toàn cũng như kiểm tra độ lặp lại của phản ứng, mỗi mẫu s được cắt (quá trình ủ) ở 2 điểm thời gian trong vùng thời gian cắt đã được chúng tôi tối ưu.
Bảng 2.2. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKOR1
Thành phần Thể tích 1 phản ứng (7,5 µl) Điều kiện phản ứng DNA 3,0 µl Ủ ở nhiệt độ: 370C trong 2 điều kiện: 30 và 45 phút 10 X Buffer 0,75 µl Enzym Msp1 0,15 µl DDW 3,6 µl \
Bảng 2.3. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9934438 trên gen VKORC1 Thành phần Thể tích 1 phản ứng (7,5 µl) Điều kiện phản ứng DNA 3,0 µl - Ủ ở nhiệt độ: 370 C trong 2 điều kiện: 15 và 30 phút. - Bất hoạt ở nhiệt độ: 800C trong 5 phút. 10 X Buffer 0,75 µl Enzym HinfI 0,15 µl DDW 3,6 µl
Kiểm tra kết quả RFLP của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1 bằng phương pháp điện di trên agarose 1,5% trong thời gian 45 phút, hiệu
điện thế 100 V (quy trình và các bước điện di kiểm tra kết quả giống với quy trình điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR ở mục 2.4.5.2). Ảnh điện di được ghi lại bằng hệ thống chụp ảnh điện di Gel-DocItx. So sánh kết quả điện di với Marker 100 - 4 kb Plus.
2.4.8.2. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp giải trình tự gen ở 20 mẫu nghiên cứu đầu tiên.
Sau khi có kết quả phân tích kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp RFLP. Để kiểm tra độ chính xác của phương pháp này, chúng tôi cũng tiến hành phương pháp giải trình tự gen ở 20 mẫu bệnh nhân đầu tiên. Nếu kết quả của cả hai phương pháp như nhau, điều đó cho thấy quy trình và điều kiện phản ứng của phương pháp RFLP được tối ưu tốt và cho kết quả chính xác. Do đó, các mẫu bệnh nhân tiếp theo chúng tôi s sử dụng phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen
VKORC1. Vì phương pháp này cho kết quả nhanh và hiệu quả kinh tế cho bệnh
nhân đồng thời cũng tiết kiệm thời gian nghiên cứu.
Dùng 25 µl sản phẩm PCR lên băng điện di đặc hiệu, sáng rõ sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự gen tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9. Kết quả kiểu gen của các đa hình được xác định dựa trên các ảnh giải trình tự thu được.