rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1
1.4.4.1. Phương pháp PCR - giải trình tự gen
Phương pháp PCR
PCR (polymerase chain reaction) được dùng để khuếch đại một chuỗi DNA (DNA đích). Trong quá trình sao chép, các sợi DNA tách nhau ra và mỗi sợi của phân tử DNA bố mẹ lại làm khuôn để tổng hợp lên các sợi DNA con theo nguyên tắc bổ sung. Quá trình sao chép hoàn toàn dựa trên nguyên tắc Watson và Crick: A bổ sung với T; G bổ sung với C và luôn đảm bảo tính bảo tồn cao, ít sai sót [12].
Nguyên tắc của phương pháp PCR là dựa trên sự thay đổi nhiệt độ ở 3 giai đoạn khác nhau của quá trình phản ứng:
+ Giai đoạn 1 là giai đoạn biến tính
+ Giai đoạn 2 là giai đoạn gắn mồi và giai đoạn kéo dài chuỗi + Giai đoạn 3 là kết thúc
Quá trình PCR chỉ sử dụng những thành phần cơ bản của toàn bộ hệ thống sao chép phức tạp trong tự nhiên để sao chép một phân đoạn ngắn DNA trong ống nghiệm [12]. Các cặp oligonucleotid mồi gắn đặc hiệu với một đoạn của chuỗi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Hai chuỗi xoắn kép trong phân tử DNA khuôn được tách rời nhau bởi nhiệt độ. Nhiệt độ cao phá vỡ các liên kết hydro giữa các đôi base. Quá trình này gọi là quá trình biến tính. Các cặp mồi sau đó liên kết bổ sung với chuỗi DNA khuôn và enzym DNA polymerase bắt đầu quá trình gắn các đươn vị deoxynucleotid vào vị trí 3'-OH của mồi để tạo thành các phân tử kẹp đôi mới. Các mồi lại gắn vào khuôn theo nguyên tắc bổ sung và quá trình kéo dài sợi tiếp tục diễn ra. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân thành hai bản sao, và nếu chu kỳ được lặp lại liên tục 25 - 35 lần thì từ một DNA đích s được khuếch đại lên 225 đến 235 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao [5][12][13].
Phương pháp giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotid trong phần tử DNA [72]. Giải trình tự gen sử dụng máy giải trình tự tự động [72]:
Máy giải trình tự gen tự động hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Máy bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản s đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu s ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G [72].
Ưu điểm của phương pháp xác định kiểu gen của SNP phương pháp bằng giải trình tự gen: kết quả chính xác, rõ nét, không cần thực hiện nhiều các thao tác kĩ thuật, quy trình kĩ thuật hiện đại do sử dụng hệ thống máy tự động.
Hình 1.12. Giải trình tự gen bằng máy tự động [72]
1.4.4.2. Phương pháp cắt bằng enzym giới hạn (RFLP - Restriction fragment length polymorphism)
Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzym giới hạn (Restriction Enzym, RE). Khi ủ DNA với enzym giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp với pH, nhiệt độ thích hợp s tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ
gen [12][70]. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các RE đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể s tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau [70].
Trình tự nhận biết của enzym giới hạn (RE)
Mỗi một enzym giới hạn nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệu đối với nó và được gọi là trình tự nhận biết (chuỗi đích) hay đoạn đọc ngược xuôi. Enzym giới hạn mang tính đặc hiệu cao, mỗi enzym chỉ có thể nhận biết một đoạn trình tự đặc thù các cặp bazơ trên DNA. Đoạn nhận biết phổ biến nhất có chiều dài 4 - 5 hoặc 6 nucleotide tương ứng với khoảng 44 = 256 cặp bazơ, 45 = 1024 cặp bazơ, hoặc 46 = 4096 cặp bazơ có khả năng lặp lại một lần trong cấu trúc chung của DNA. Như vậy, RE nhận biết đoạn trình tự nucleotide s cắt phân tử DNA ngắn hơn các RE nhận biết đoạn trình tự 5 hoặc 6 nucleotide [9][12].
Các kiểu cắt của RE
Hình 1.13. Enzym cắt tạo đầu dính và cắt tạo bằng [110]
Cắt tạo ra đầu bằng (blunt ends) (Hình 1.13): enzym giới hạn cắt đầu bằng không tự nối các đoạn DNA lại với nhau. Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa palindromic. Để nối các đoạn DNA sau khi cắt cần sử dụng enzym nối ligase và các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzym [74].
Cắt tạo ra đầu dính (cohesive ends) (Hình 1.13): enzym giới hạn cắt đầu so le tạo đầu dính. Sau khi cắt chúng có thể tự nối lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung. Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền [74].
Ưu điểm của phương pháp RFLP
Phân tích RFLP dựa trên nguyên tắc đa hình vị trí giới hạn trong các phân đoạn DNA được nhân bản bởi kỹ thuật PCR. Những phân đoạn như vậy có thể được phân tách bằng cách chạy điện di trên gel agarose, nhờ nhuộm màu gel bằng ethidium bromide, tính đặc thù của các đoạn này có thể được quan sát trực tiếp hoặc chụp ảnh qua máy soi DNA. Số lượng và kích thước của các phân đoạn s phản ánh sự phân bố của những vị trí cắt trong phân tử DNA. Sự hiện diện của các đoạn cắt này mang tính đặc trưng cho từng tổ hợp DNA/RE. Người ta có thể sử dụng phương pháp xác định kiểu gen RFLP để đánh giá trực tiếp tính biến dị di truyền của sinh vật [74].
Phương pháp RFLP có ưu điểm: kỹ thuật đơn giản, kết quả rõ ràng, nhanh, tiết kiệm chi phí và độ tin cậy cao. Kỹ thuật RFLP là công cụ hữu hiệu trong trường hợp cần xác định sự có mặt của đột biến tạo ra trong phản ứng PCR, mà đột biến này cấu thành vị trí cắt của enzym là sợi DNA khuôn ban đầu không có [74].