43
4.7. Phương pháp thu nhận E:
* Lưu ý: Phải chọn đúng nguyên liệu có hàm lượng E cần thu nhận cao.
Phá vỡ màng tế bào để giải phóng E. Các phương pháp: + Phương pháp cơ học: + Phương pháp vật lý: + Phương pháp hoá học:. + Phương pháp sinh học:
Chiết E và chuyển E thành dạng dung dịch E
Sử dụng dung môi thích hợp (nước, dung dịch đệm có pH phù hợp với E hoặc dung dịch muối loãng, . . .)
kết tủa E từ dung dịch E
+ Dùng dung môi hữu cơ (dung môi làm giảm hằng số điện môi) làm giảm độ hoà tan và gây kết tủa E, thường dùng aceton hoặc etanol.
+ Dùng muối trung tính (ở nồng độ muối cao thì muối tranh giành vỏ nước bên ngoài; khi mất vỏ nước thì nó dễ ngưng tụ lại với nhau). Thường dùng NaCl và (NH4)2SO4. Nồng độ bão hoà của NaCl ≈ 22-23%. Nồng độ bão hoà của (NH4)2SO4 ≈ 70-72%. + Dùng điểm đẳng điện P I để kết tủa E. Điểm đẳng điện tại pH = PI thì tổng điện tích (+) + (-) = 0; phân tử E trung hoà điện và kết tủa. Mỗi E có 1 PI riêng.
Vd: PI pepsin = 1 – 1,2 PI trypsin = 9 – 10.
⇒ là phương pháp tinh sạch E có hiệu quả.
1 4 3 V v E dd môi dung = ÷
45
Sau khi kết tủa E, ta ly tâm hay lọc bỏ dung dịch để lấy kết tuả E. Sấy kết tủa E để được dạng bột E khô
(sấy ≤ 500C). Có thể sấy bằng quạt gió , chân không. Sau khi sấy được chế phẩm E thô dạng khô → bảo quản được lâu.
Sơ đồ thu Enzyme:
Tinh chế và tinh sạch E để được E tinh khiết cao để phục vụ trong Y Dược, nghiên cứu khoa học.
+ Phương pháp Dialise (thẩm tích): đây là phương pháp sử dụng màng lọc bán thấm Sau 24h, chất có M nhỏ sẽ thấm qua màng và hoà vào nước. Ứng dụng phương pháp này để lọc các tạp chất có M nhỏ.
+ Phương pháp lọc qua gel – Sephadex: cho qua cột gel Sephadex: nó có tính chất sàng lọc các chất có trọng lượng phân tử khác nhau.
+ Phương pháp trao đổi ion: sử dụng nhựa trao đổi ion Do khả năng trao đổi ion khác nhau của các cấu tử mà chúng ta có thể tách các tạp chất ra khỏi E.
47
+ Phương pháp hấp phụ: sử dụng những chất hấp phụ thích hợp hấp phụ tạp chất và cho E chảy qua.
+ Phương pháp điện di: di chuyển trong điện trường, dựa trên cơ sở các cấu tử khác nhau thì có khả năng dịch chuyển với những tốc độ khác nhau theo hướng khác nhau trong điện trường.Sau 1 thời gian t các cấu tử sẽ tách rời khỏi nhau.
+ Phương pháp sắc ký: sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, . . .dựa vào sự phân bố khác nhau của các cấu tử vào 2 pha
Pha tĩnh: nước + chất mang
Pha động: dung môi dịch chuyển
Do sự phân bố khác nhau của các cấu tử ở 2 pha, các cấu tử sẽ tách khỏi nhau.
4.8. Đánh giá chất lượng E qua xác định hoạt tính:
Chất lượng của sản phẩm E thu được được đánh giá qua việc xác định hoạt tính xúc tác của E (khả năng phân giải cơ chất tạo sản phẩm).
Định nghĩa: đơn vị hoạt tính là lượng E có khả năng xúc tác
chuyển hoá 1 micromol (µm) cơ chất sau 1 phút ở điều kiện chuẩn. Ký hiệu: đvht (UI)
ΣUI/ ml dd E
Hoạt tính riêng = ΣUI/mg Pr-E.
Hoạt tính riêng biểu thị mức độ tinh khiết của E. Khi hoạt tính riêng càng cao thì mức độ E càng cao.
49