3. Nội dung nghiên cứu
3.2. Kết quả xác định kiểu gen (genotype) của virus viêm gan B bằng kỹ
thuật PCR lồng (Nested – PCR)
Dựa trên việc so sánh genome của virus, các chủng virus viêm gan B (HBV) phân lập trên thế giới đã được phân vào 6 nhóm kiểu gen và được ký hiệu thành các genotype A, B, C, D, E và F. Các genotype của HBV có sự phân bố đặc thù theo khu vực địa lý. Việc xác định kiểu gen của HBV bằng phân tích phát sinh loài dựa trên các trình tự nucleotide tạo ra các kết quả ổn định và đáng tin cậy nhất. Tuy nhiên, đây không phải là phương pháp phù hợp cho việc xác định kiểu gen HBV trên quy mô lớn. Chính vì vậy, một phương pháp xác định đơn giản hơn, nhanh hơn để xác định kiểu gen đặc hiệu của HBV đã được sử dụng trong nghiên cứu này, đó là kỹ thuật nested-PCR.
Để xác định kiểu gen của HBV bằng kỹ thuật nested-PCR, chúng tôi đã sử dụng các mẫu DNA đã được tách chiết và tinh sạch mà thực tế cho kết quả HBV-DNA dương tính trong phản ứng định lượng Real-time PCR làm DNA khuôn mẫu cho phản ứng vòng ngoài của nested-PCR. Trình tự cặp mồi P1 và S1-2 của phản ứng vòng ngoài nested-PCR (cặp mồi bên ngoài) được tham khảo từ nghiên cứu của Hideo Naito [33]. P1 và S1-2 được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide có tính bảo thủ trong các vùng từ gen pre-S1 đến S mà nó không phân biệt trong 6 genotype đặc hiệu của HBV (A, B, C, D, E và F). Sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR vòng ngoài được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR vòng trong, sản phẩm khuếch đại của phản ứng vòng 2 được điện di kiểm tra trên gel agarose 3%, soi và kiểm tra bản gel trên máy BioDoc-ItTM Imasing System.
Với phản ứng PCR vòng trong: Nhóm I cho phép phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu của genotype A, B và C (như hình 3.7). Nhóm 2 đặc hiệu của genotype D, E và F.
Hình 3.7: Sản phẩm PCR vòng 2 với nhóm I (kiểu gen A, B, C) trên bản gel điện di
M. DNA ladder 100bp; 1. Chứng âm; Type A (1,2,3,5 và 6); Type B (7); Type C (4)
Phân tích kết quả điện di hình 3.5 cho thấy có 3 phân đoạn DNA được khuếch đại từ phản ứng PCR vòng trong (nhóm I). Đoạn thứ nhất có kích thước khoảng 68bp, (đường chạy 1, 2, 3, 5 và 6) hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết của genotype A. Trên các đường chạy số 4 là đoạn DNA có kích thước khoảng 122bp tương ứng với genotype C và đoạn thứ ba có kích thước khoảng 281bp (đường chạy số 7) tương ứng với genotype B.
Trong tổng số 74 mẫu huyết thanh cho kết quả dương tính với HBV- DNA, qua kết quả PCR vòng trong đã xác định được 3 kiểu gen của HBV là A, B và C. Không phát hiện các kiểu gen khác. Tỷ lệ các kiểu gen của HBV được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ kiểu gen của HBV trên một số bệnh nhân viêm gan B tại tỉnh Thái Nguyên
Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ %
A 11 14,86%
B 37 50%
C 26 35,14%
Tổng số 74 100%
Kết quả bảng 3.1 cho thấy trong tổng số 74 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan B được khảo sát có ba type HBV được tìm thấy với sự phân bố như sau: kiểu gen A có 11/74 chủng chiếm 14,86%, kiểu gen B có 37/74 chủng chiếm 50% và kiểu gen C có 26/74 chủng chiếm 35,14%. Kết quả phản ứng PCR vòng trong cho thấy không có bất kỳ chủng HBV nào trong nghiên cứu thuộc một trong các kiểu gen D, E hoặc F.
Mới chỉ có một vài nghiên cứu phát hiện kiểu gen của virus viêm gan B lưu hành tại một số khu vực ở Việt Nam và được thực hiện với số lượng mẫu huyết thanh có HBsAg(+) cũng còn khiêm tốn.
Trong nghiên cứu của mình tiến hành năm 2005, Đỗ Thị Thanh Thủy và cộng sự đã xác định được 80% số chủng HBV thuộc kiểu gen B, 20% còn lại thuộc kiểu gen C, không tìm thấy các kiểu gen D, E và F [11].
Kiểu gen B (58,18%) và kiểu gen C (40,0%) cũng đã được xác định trong tổng số 55 mẫu huyết thanh có HBsAg(+) trong nghiên cứu do Hoàng Xuân Sử và cộng sự thực hiện năm 2009 [9].
Trong nghiên cứu được tiến hành năm 2001 với 55 mẫu huyết thanh dương tính với HBV-DNA thu thập từ 6 quốc gia là Nhật Bản, Việt Nam, Hoa Kỳ, Ai-cập, Ghana và Bolivia, Naito và cộng sự đã cho thấy trong tổng
số 30 mẫu huyết thanh từ Việt Nam thì có 33% số mẫu huyết thanh thuộc kiểu gen B, 63% thuộc kiểu gen C và 3,0% không xác định được kiểu gen [30].
Như vậy, qua kết quả của các nghiên cứu trước đây cũng như nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, tỷ lệ các kiểu gen của HBV ở Việt Nam có sự khác nhau qua từng nghiên cứu. Điều này có thể do các nghiên cứu được tiến hành ở các thời điểm khác nhau và tại các khu vực khác nhau, với số mẫu nghiên cứu còn hạn chế và chưa có tính đại diện. Có một sự khác biệt trong kết quả xác định kiểu gen HBV trong nghiên cứu của chúng tôi so với những nghiên cứu được tiến hành trước đây đó là ngoài 2 kiểu gen B và C đã được các nhóm tác giả tìm thấy, chúng tôi còn phát hiện được 14,86% số mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan B trong nghiên cứu thuộc kiểu gen A. Sự xuất hiện của kiểu gen A trong nghiên cứu của chúng tôi có thể là do sự lan truyền của kiểu virus này từ bên ngoài vào Việt Nam trong thời gian gần đây. Tuy nhiên, đây mới chỉ là giả thiết, để có thể xác định được nguồn gốc dịch tễ học phân tử của các chủng HBV có kiểu gen A này thì cần khảo sát sự lưu hành của kiểu gen này trên số mẫu lớn hơn và tại các khu vực khác của Việt Nam, cũng như tiến hành giải trình tự gen của kiểu gen A đã xác định.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
Nhóm nghiên cứu đã tách chiết HBV DNA với độ tinh sạch cao. Xác định được hàm lượng HBV DNA chính xác trên 74 mẫu HBV DNA bằng kỹ thuât Real-time PCR.
Nhóm đã ứng dụng thành công quy trình kỹ thuật Nested-PCR của Naito và cộng sự trong xác định kiểu gen của HBV ở 74 mẫu bệnh phẩm huyết thanh của bệnh nhân nhiễm virus HBV (có HBV-DNA (+)) tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu đã xác định được kiểu gen A chiếm 14,86%, kiểu gen B chiếm 50% và kiểu gen C chiếm 35,14%. Không tìm thấy kiểu gen D, E và F trong số các mẫu huyết thanh viêm gan B được nghiên cứu.
2. Đề nghị
Cần tiếp tục nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn, giải trình tự gen của các kiểu gen đã xác định, đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen của HBV với một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, tính kháng thuốc ở bệnh nhân nhiễm HBV.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt:
1. Đông thị Hoài An, Cao Minh Nga (2003), Kỹ thuật định típ gene siêu vi viêm gan B bằng Multiplex PCR trên bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mạn, Từ khoa học sinh học phân tử ñến cuộc sống và chăm sóc sức khỏe, tr. 17-25.
2. Bùi Đại (2002), Viêm gan vi rút B và D, Nhà xuất bản Y học.
3. Đỗ Đức Hiền (2010), Bệnh học lao và bệnh phổi, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 4. Bùi Hữu Hoàng (2002), Đặc điểm của dấu ấn huyết thanh và kiểu gene
của virus viêm gan B trên bệnh nhân xơ gan và ung thư gan, Luận văn tốt nghiệp trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh.
5. Bùi Hữu Hoàng, Đinh Dạ Lý Hương, Phạm Hoàng Phiệt, Erwin Sablon (2003), “Kiểu gen của siêu vi viêm gan B ở bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Chuyên đề Nội khoa, tập 7, phụ bản số 1:128-133.
6. Đặng Văn Khoa (2010), Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, đáp ứng miễn dịch, tính kháng thuốc ở bênh nhân lao phổi mới và lao phổi tái phát, Luận án tiến sỹ Y học, Trường ĐH Y Hà Nội.
7. Phạm Song (chủ biên) (1991), Viêm gan do vi rút (A, B, NonA/Non B).
Bách khoa thư bệnh học, tập 1, Trung tâm Quốc gia biên soạn từ điển bách khoa Việt Nam.
8. Phạm Song (2000), Viêm gan do vi-rút, Bách khoa thư bệnh học, Nhà xuất bản Từ điển bách khoa, Hà Nội, tr. 340-361.
9. Hoàng Xuân Sử, Nguyễn Lĩnh Toàn, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Thái Sơn (2009), “Phát triển kỹ thuật Multiplex - PCR xác định kiểu gen của virus viêm gan B”, Tạp chí Y học thực hành số 9/2009.
10. Nguyễn Thị Minh Thư, Phạm Hùng Vân (2005), Định type và phát hiện đột biến kháng Lavumidine của virus viêm gan B bằng kỹ thuật giải trình tự, từ nguồn www. drthuthuy.com.
11. Đỗ Thị Thanh Thủy, Phạm Hùng Vân, Nguyễn Phạm Thanh Nhân (2005), “Xác định genotype của virus gây viêm gan B trong các mẫu huyết thanh của bệnh nhân bị nhiễm HBV”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, Tập 9 - Số 2.
12. Ngô Thị Quỳnh Trang (2011), Xác định tỉ lệ nhiễm virus viêm gan B (HBsAg) và virus viêm gan C (Anti HCV) trong huyết thanh người tại một xã vùng đồng bằng Bắc Bộ Việt Nam năm 2011, Luận văn Thạc sĩ khoa học, trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội.
13. Phạm Văn Ty (2005), Virut học, Nhà xuất bản Giáo dục.
B. Tài liệu tiếng Anh:
14. Abe K, Tran HT (2004), “Genotyping of hepatitis B virus by PCR using type-specific primers and geographic distribution of the genotypes”, Nihon Rinsho, Aug;62 Suppl 8:153-9.
15. Anna SF Lok, Rafael Esteban, Peter A L Bonis (2009), Serologic diagnosis of hepatitis B virus infection, Up to date version 17.1.
16. Bock C.T. and H. Zentgraf (1993), “Detection of minimal amounts of DNA by electron microscopy using simplified spreading procedures”,
Chromosoma, 102(4): p. 249-52.
17. Bruss V (2007), Hepatitis B virus morphogenesis, Word Journal of Gastroenterology, p. 65-73.
18. Cheng DX, Ye GL, Lin Y, Chen ZH (2009), “The analysis of hepatitis B virus genetic characterization from immuned children and their mother”, Xiang Shan Country First People Hospital, Zhejiang 315700, China. Jun; 23(3):194-6
19. Chomczynski P, Sacchi N (1987), “Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction”, Ana. Biochem. 162, 156–159
20. Chu CJ, Keeffe EB, Han SH, Perrillo RP, Min AD, Soldevila-Pico C, Carey W, Brown RS Jr, Luketic VA, Terrault N, Lok AS (2003), “Hepatitis B virus genotypes in the United States: results of a nationwide study’, Gastroenterology, 125(2): p. 444-51.
21. Fung S.K. and A.S. Lok (2004), “Hepatitis B virus genotypes: do they play a role in the outcome of HBV infection?”, Hepatology, 40(4): p. 790-792. 22. Garfein R.S, Bower W.A, Loney C.M, Hutin Y.J, Xia G.L, Jawanda J
(2004), “Factors associated with fulminant liver failure during an outbreak among injection drug users with acute hepatitis B”, Hepatology, v. 40, p. 865-873.
23. Ganem D, Prince AM (2004), Hepatitis B virus infection - natural history and clinical consequences, N Engl J Med; 350:1118-1129.
24. Geramizadeh B, Kaboli R, Behzad-Behbahani A, Rahsaz M, Azarpira N, Aghdai M, Aytollahi M, Yaghoobi R, Baneehashemee M (2008), “A Nested PCR Method for the Identification of Hepatitis B Virus Genotype in Paraffin Blocks of Formalin-Fixed Liver Biopsies ”, Arch Iran Med., Jul;11(4):455-8. doi: 08114/AIM.0019.
25. Guirgis BSS, Abbas RO, Azzazy H.M.E (2010), “Hepatitis B virus genotyping: current methods and clinical implications”, Int J Infect Dis, 14:E941– E953.
26. Holliday S.M. and Faulds D (1994), ‘Hepatitis B vaccine: a pharmacoeconomic evaluation of its use in the prevention of hepatitis B virus infection”, Pharmacoeconomics, 5(2): p. 141-71.
27. Jing-Jing Nie, Kui-Xia Sun, Jie Li, Jie Wang, Hui Jin, Ling Wang, Feng- Min Lu, Tong Li, Ling Yan, Jing-Xian Yang, Mi-Shu Sun and Hui Zhuang (2012), “A type-specific nested PCR assay established and applied for investigation of HBV genotype and subgenotype in Chinese patients with chronic HBV infection”, Virology Journal, 9 :121.
28. Kirschberg O, Schüttler C, Repp R, Schaefer S (2004), “A multiplex-PCR to identify hepatitis B virus--enotypes A-F”, J Clin Virol, 29(1): p. 39-43. 29. Kreutz C (2002), “Molecular, immunological and clinical properties of
mutated hepatitis B viruses”, J. Cell Mol, Med, 6 (1), 113-143.
30. Liu WC, Lindh M, Buti M, Phiet PH, Mizokami M, Li HH, Sun KT, Young KC, Cheng PN, Wu IC, Chang TT (2008), “Genotyping of hepatitis B virus genotypes A to G by multiplex polymerase chain reaction”,
Intervirology, 51:247–52.
31. Mamun-Al Mahtab, Salimur Rahman, Mobin Khan and Fazal Karim (2008), Hepatitis B virus geneotypes: an overview, Hepatobiliary Pancreat Dis Int.
32. Mayerat C, Mantegani A, Frei P.C (1999), “Does hepatitis B virus (HBV) geneotype influence the clinical outcome of HBV infection?”, J Viral Hepat, v. 6, p. 299-304.
33. Mizokami M, Nakano T, Orito E, Tanaka Y, Sakugawa H, Mukaide M, Robertson BH (1999), “Hepatitis B virus genotype assignment using restriction fragment length polymorphism patterns”, FEBS Lett, 450(1-2): p. 66-71.
34. Naiel Bisharat, Mazen Elias, Raul Raz & Edith Flatau (1998), “Familial pattern of infection with hepatitis B virus among immigrating Ethiopian Jews in Israel”, Eur J Epidemiol, 14(1): p. 89-91.
35. Naito H, Hayashi S, and Abe K (2001), “Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers”, J Clin Microbiol, 39(1): p. 362-4.
36. Norio Akuta and Hiromitsu Kumada (2005), “Influence of hepatitis B virus geneotypes on the response to antiviral therapies”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 55, p. 139 - 142.
37. Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M (1988), “Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes”, J Gen Virol, 69 ( Pt 10): p. 2575-83.
38. Rodriguez-Frias F, Buti M, Jardi R, Cotrina M, Viladomiu L, Esteban R (1995), “Hepatitis B virus infection: precore mutants and its relation to viral geneotypes and core mutations”, Hepatology, v. 22, p. 1641-1647. 39. Sánchez-Tapias J, Costa J, Mas A, Bruguera M, Rodes J (2002),
“Influence of hepatitis B virus geneotype on the longterm outcome of chronic hepatitis B in western patients”, Gastroenterology, v. 123, p. 1848-1856.
40. Shiina S, Fujino, Uta, Tagawa K, Unuma T, Yoneyama M (1991), “Relationship of HBeAg subtypes with HBeAg/anti-HBe status and chronic liver disease Part I: Analysis of 1744 HBeAg carriers”, Am J Gastroenterol, v. 86, p. 866-871.
41. Song Y, Dai E, Wang J, Liu H, Zhai J, Chen C, Du Z, Guo Z, Yang R (2006), “Genotyping of hepatitis B virus (HBV) by oligonucleotides microarray”, Mol Cell Probes, 20(2): p. 121-7.
42. Sumi H, Yokosuka, Seki N, Arai, Imazeki, Kurihara T (2003), “Influence of hepatitis B virus geneotypes on the progression of chronic type B liver disease”, Hepatology, v. 7, p. 19-26.
43. Tsang TK, Blei AT, O'Reilly DJ, Decker R (1986), “Clinical significance of concurrent hepatitis B surface antigen and antibody positivity”, Dig Dis Sci, 31:620.
44. Veronica L. Mathet and Maria L. Cuestas (2009), Genetic diversity and variability of hepatitis B virus, Nova Science Publishers, Inc.
45. William M, Lee (1997), “Haepatitis B virus infection”, Medical aprogress 337, v. 24, p. 1733-1745.
46. World Health Organization (2001), Introduction of hepatitis B vaccine into childhood immunization services, WHO/V&B/01.31.
47. World Health Organization (2002), WHO/CDS/CSRL/LYO/2002: Hepatitis B
48. Xin Ding, Hongxi Gu (2003), “Molecular epidemiology of Hepatitis virus and Geneotypic distribution Hepatitis B and C virusin Harbin China” Jpn.J.Infect.Dis, p. 19-22.
49. Yeh S.H, Tsai C.Y, Kao J.H, Liu C.J, Kuo T.J, Lin M.W, Huang W.L, Lu S.F, Jih J, Chen D.S, and Chen P.J (2004), “Quantification and genotyping of hepatitis B virus in a single reaction by real-time PCR and melting curve analysis”, J Hepatol, 41(4): p. 659-66.
C. Tài liệu Website:
PHỤ LỤC 1
DANH SÁCH BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B ĐƯỢC XÁC ĐỊNH KIỂU GEN HBV BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED - PCR)
STT Họ và tên Tuổi Địa chỉ Ngày lấy mẫu
1 Dương Quốc Th. 31 Phú Lương, Thái Nguyên 5/1/2016
2 Nguyễn Việt H. 28 Quyết Thắng, Thái Nguyên 6/1/2016
3 Nguyễn Thị Thu H. 40 P. Đồng Quang, Thái Nguyên 12/1/2016
4 Nguyễn Văn T. 55 P. Đồng Quang, Thái Nguyên 12/1/2016
5 Đặng Văn B. 34 P. Túc Duyên, Thái Nguyên 12/1/2016
6 Trần Văn H. 34 Phú Xá, Thái Nguyên 14/01/2016
7 Quách Thị Q. 31 Đồng Bẩm, Thái Nguyên 14/01/2016
8 Dương Trung T. 21 CĐ Y Tế Thái Nguyên 14/01/2016
9 Nguyễn Thị L. 65 Tân Thịnh, Thái Nguyên 19/1/2016
10 Phạm Văn V. 25 Bàn Đạt, Phú Bình, Thái Nguyên 16/02/2016