3. Nội dung nghiên cứu
2.3.5. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di
Sau khi kết thúc phản ứng PCR, 5µl sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 3% trong TAE 1X cùng với marker DNA chuẩn 100bp.
Gel điện di được ngâm trong 10 phút với dung dịch ethidium bromide. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV. Các băng DNA được xác định bằng cách đo với marker chuẩn.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết HBV-DNA tổng số
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng axít nucleic đủ lớn và đủ tinh sạch để sử dụng cho các thí nghiệm kế tiếp. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết axit nucleic là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn, với lượng tối đa, không bị đứt gãy do các tác động cơ học (phân tử bị đứt gãy do nghiền, lắc mạnh) hoặc bị phân hủy bởi các enzyme có trong tế bào và từ môi trường ngoài. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chất tẩy rửa mạnh SDS và proteinase K để tiến hành tách chiết DNA tổng số.
106 mẫu huyết thanh của những bệnh nhân có kết quả HBsAg dương tính (phát hiện được kháng nguyên bề mặt HBsAg của virus viêm gan B) đã được sử dụng để tách chiết DNA bằng phương pháp tủa. Hàm lượng và độ tinh sạch của mẫu DNA sau tách chiết đều được kiểm tra.
Kết quả đã phát hiện được HBV-DNA bộ gen trong 74/106 mẫu huyết thanh của các trường hợp mang HBsAg dương tính. Các kết quả đều cho thấy DNA đạt hàm lượng ổn định, tỷ số OD đo ở bước sóng 260 và 280 đều nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. Điều này chứng tỏ DNA của chúng tôi tách được là sạch, không nhiễm protein, RNA và phenol (Phục lục 2).
Sản phẩm DNA tinh sạch thu nhận sau quá trình tách chiết đã được sử dụng để phát hiện DNA tổng số của của virus viêm gan B (HBV-DNA) bằng kỹ thuật Realtime-PCR thông qua xét nghiệm tải lượng HBV (đếm số lượng virus/ml huyết thanh) theo yêu cầu của các bác sĩ lâm sàng.
Để phát hiện HBV-DNA và xác định được số lượng virus/ml huyết thanh thì trong mỗi phản ứng Realtime-PCR, cùng với các mẫu xét nghiệm đều có bộ nồng độ chuẩn dương gồm 4 nồng độ 102, 104, 106 và 108 copies, đối chứng dương để đảm bảo sự khuếch đại trong phản ứng là đủ nhạy (phản
ứng khuếch đại không bị ức chế), đối chứng âm để đảm bảo quá trình thao tác trong xét nghiệm không bị ngoại nhiễm (loại bỏ hiện tượng dương tính giả của các mẫu xét nghiệm). Trong đối chứng âm còn có chứng nội tại để chứng minh khâu tách chiết DNA từ mẫu thử đạt độ nhạy và loại bỏ hiện tượng âm tính giả. Trong các mẫu xét nghiệm đều có chứng nội tại để đảm bảo nếu mẫu âm tính thì là âm tính thực sự chứ không phải là âm tính giả do phản ứng khuếch đại bị ức chế, âm tính thực sự thể hiện mẫu đó dương tính với chứng nội tại.
Hình 3.1: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của một bệnh nhân nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR
Hình 3.1. cho thấy tín hiệu huỳnh quang màu FAM của mẫu xét nghiệm, đối chứng dương và đối chứng âm. Với đối chứng dương và mẫu xét nghiệm cho thấy tín hiệu huỳnh quang tuyến tính của màu FAM đều vượt qua đường nền (base line), với đối chứng âm tín hiệu huỳnh quang màu FAM nằm dưới đường nền. Khi kết hợp các kết quả tín hiệu huỳnh quang này với thông số của phản ứng và tín hiệu huỳnh quanh của các chứng nội tại sẽ cho thấy phản ứng đạt yêu cầu.
* Phân tích các nồng độ chuẩn (đường standar):
Qua hình 3.1. cho thấy các nồng độ chuẩn trong phản ứng đều đạt yêu cầu, các đường chuẩn dương có các vị trí của đường base line đạt các thông
số trên thì nồng độ chuẩn đạt tiêu chuẩn (102: có tín hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tín hiệu nền ở chu kỳ 31-34; 104: có tín hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tín hiệu nền ở chu kỳ 24-27; 106: có tín hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tín hiệu nền ở chu kỳ 17-20 và 108: có tín hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tín hiệu nền ở chu kỳ 10-13).
Để tiết kiệm chi phí cho mỗi xét nghiệm, nhóm nghiên cứu đã thực hiện chạy phản ứng Real-time PCR theo từng nhóm bệnh nhân gồm 15-20/74 mẫu HBV – DNA đã tách chiết.
* Các thông số:
Trong phản ứng Real-time PCR luôn có 3 thông số được sử dụng để đánh giá chất lượng của phản ứng, đó là hệ số tuyến tính R2 và hiệu suất phản ứng Efficiency. Trong ba thông số kể trên thì cần đặc biệt quan tâm với hệ số tuyến tính R2 đánh giá độ chính xác của thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn (pipetting) có đúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R2 phải đạt trong khoảng 0.960-1.000 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao. Hiệu suất phản ứng PCR Efficiency có thể ảnh hưởng đến chu kỳ ngưỡng. Một khi PCR đạt hiệu suất lý tưởng, thì cứ sau mỗi chu kì nhiệt, cường độ huỳnh quang trong một ống phản ứng phải tăng gấp đôi, khi đó hiệu suất nhân bản là 100%. Hiệu suất PCR thực tế chấp nhận được trong khoảng 90%-115%. Thông số cuối cùng của phản ứng cũng cần được quan tâm đó là độ dốc Slope, trị số của thông số này phải đạt trong khoảng -3 đến -4.
Hình 3.2. cho thấy hệ số tuyến tính R2 của phản ứng là 0,995 nằm trong khoảng 0.960-1.000. Hiệu suất nhân bản PCR efficiency là 98% nằm trong khoảng 90-115% và hệ số dốc Slope là -3.36 nằm trong khoảng -3 đến -4. Các thông số đều cho thấy phản ứng khuếch đại đạt yêu cầu.
* Phân tích đối chứng dương, đối chứng âm:
Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng dương và chứng âm
Hình 3.3 cho thấy chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính), đối chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính. Kết quả này cho thấy phản ứng khuếch đại đạt yêu cầu.
* Phân tích mẫu xét nghiệm dương tính:
Hình 3.4 cho thấy mẫu xét nghiệm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính). Kết quả này cùng với kết quả phân tích đối chứng dương và đối chứng
âm cho thấy mẫu xét nghiệm là dương tính thực sự (phát hiện được HBV- DNA trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân).
Với những mẫu xét nghiệm có chứng nội tại dương tính thì đều được kết luận mẫu âm tính thật sự (không phát hiện được HBV-DNA trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân).
Hình 3.4: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của một mẫu xét nghiệm dương tính
* Kết quả phát hiện HBV-DNA tổng số:
Qua tiến hành phản ứng Real-time PCR với mẫu huyết thanh của 106 bệnh nhân có xét nhiệm HBsAg dương tính, kết quả cho thấy đã phát hiện được 74 mẫu huyết thanh cho kết quả HBV-DNA dương tính thực sự. Số mẫu huyết thanh còn lại (32 mẫu) là âm tính (không tìm thấy HBV-DNA trong mẫu huyết thanh). Không có hiện tượng dương tính giả và âm tính giả trong các lần thực hiện phản ứng, điều này cho thấy chất lượng các phản ứng khuếch đại HBV-DNA đều đảm bảo yêu cầu.
Hình 3.5: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của bệnh nhân Trần Văn H. nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR
Hình 3.6: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của bệnh nhân Tô Văn Kh. nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR
3.2. Kết quả xác định kiểu gen (genotype) của virus viêm gan B bằng kỹ thuật PCR lồng (Nested – PCR) thuật PCR lồng (Nested – PCR)
Dựa trên việc so sánh genome của virus, các chủng virus viêm gan B (HBV) phân lập trên thế giới đã được phân vào 6 nhóm kiểu gen và được ký hiệu thành các genotype A, B, C, D, E và F. Các genotype của HBV có sự phân bố đặc thù theo khu vực địa lý. Việc xác định kiểu gen của HBV bằng phân tích phát sinh loài dựa trên các trình tự nucleotide tạo ra các kết quả ổn định và đáng tin cậy nhất. Tuy nhiên, đây không phải là phương pháp phù hợp cho việc xác định kiểu gen HBV trên quy mô lớn. Chính vì vậy, một phương pháp xác định đơn giản hơn, nhanh hơn để xác định kiểu gen đặc hiệu của HBV đã được sử dụng trong nghiên cứu này, đó là kỹ thuật nested-PCR.
Để xác định kiểu gen của HBV bằng kỹ thuật nested-PCR, chúng tôi đã sử dụng các mẫu DNA đã được tách chiết và tinh sạch mà thực tế cho kết quả HBV-DNA dương tính trong phản ứng định lượng Real-time PCR làm DNA khuôn mẫu cho phản ứng vòng ngoài của nested-PCR. Trình tự cặp mồi P1 và S1-2 của phản ứng vòng ngoài nested-PCR (cặp mồi bên ngoài) được tham khảo từ nghiên cứu của Hideo Naito [33]. P1 và S1-2 được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide có tính bảo thủ trong các vùng từ gen pre-S1 đến S mà nó không phân biệt trong 6 genotype đặc hiệu của HBV (A, B, C, D, E và F). Sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR vòng ngoài được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR vòng trong, sản phẩm khuếch đại của phản ứng vòng 2 được điện di kiểm tra trên gel agarose 3%, soi và kiểm tra bản gel trên máy BioDoc-ItTM Imasing System.
Với phản ứng PCR vòng trong: Nhóm I cho phép phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu của genotype A, B và C (như hình 3.7). Nhóm 2 đặc hiệu của genotype D, E và F.
Hình 3.7: Sản phẩm PCR vòng 2 với nhóm I (kiểu gen A, B, C) trên bản gel điện di
M. DNA ladder 100bp; 1. Chứng âm; Type A (1,2,3,5 và 6); Type B (7); Type C (4)
Phân tích kết quả điện di hình 3.5 cho thấy có 3 phân đoạn DNA được khuếch đại từ phản ứng PCR vòng trong (nhóm I). Đoạn thứ nhất có kích thước khoảng 68bp, (đường chạy 1, 2, 3, 5 và 6) hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết của genotype A. Trên các đường chạy số 4 là đoạn DNA có kích thước khoảng 122bp tương ứng với genotype C và đoạn thứ ba có kích thước khoảng 281bp (đường chạy số 7) tương ứng với genotype B.
Trong tổng số 74 mẫu huyết thanh cho kết quả dương tính với HBV- DNA, qua kết quả PCR vòng trong đã xác định được 3 kiểu gen của HBV là A, B và C. Không phát hiện các kiểu gen khác. Tỷ lệ các kiểu gen của HBV được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ kiểu gen của HBV trên một số bệnh nhân viêm gan B tại tỉnh Thái Nguyên
Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ %
A 11 14,86%
B 37 50%
C 26 35,14%
Tổng số 74 100%
Kết quả bảng 3.1 cho thấy trong tổng số 74 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan B được khảo sát có ba type HBV được tìm thấy với sự phân bố như sau: kiểu gen A có 11/74 chủng chiếm 14,86%, kiểu gen B có 37/74 chủng chiếm 50% và kiểu gen C có 26/74 chủng chiếm 35,14%. Kết quả phản ứng PCR vòng trong cho thấy không có bất kỳ chủng HBV nào trong nghiên cứu thuộc một trong các kiểu gen D, E hoặc F.
Mới chỉ có một vài nghiên cứu phát hiện kiểu gen của virus viêm gan B lưu hành tại một số khu vực ở Việt Nam và được thực hiện với số lượng mẫu huyết thanh có HBsAg(+) cũng còn khiêm tốn.
Trong nghiên cứu của mình tiến hành năm 2005, Đỗ Thị Thanh Thủy và cộng sự đã xác định được 80% số chủng HBV thuộc kiểu gen B, 20% còn lại thuộc kiểu gen C, không tìm thấy các kiểu gen D, E và F [11].
Kiểu gen B (58,18%) và kiểu gen C (40,0%) cũng đã được xác định trong tổng số 55 mẫu huyết thanh có HBsAg(+) trong nghiên cứu do Hoàng Xuân Sử và cộng sự thực hiện năm 2009 [9].
Trong nghiên cứu được tiến hành năm 2001 với 55 mẫu huyết thanh dương tính với HBV-DNA thu thập từ 6 quốc gia là Nhật Bản, Việt Nam, Hoa Kỳ, Ai-cập, Ghana và Bolivia, Naito và cộng sự đã cho thấy trong tổng
số 30 mẫu huyết thanh từ Việt Nam thì có 33% số mẫu huyết thanh thuộc kiểu gen B, 63% thuộc kiểu gen C và 3,0% không xác định được kiểu gen [30].
Như vậy, qua kết quả của các nghiên cứu trước đây cũng như nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, tỷ lệ các kiểu gen của HBV ở Việt Nam có sự khác nhau qua từng nghiên cứu. Điều này có thể do các nghiên cứu được tiến hành ở các thời điểm khác nhau và tại các khu vực khác nhau, với số mẫu nghiên cứu còn hạn chế và chưa có tính đại diện. Có một sự khác biệt trong kết quả xác định kiểu gen HBV trong nghiên cứu của chúng tôi so với những nghiên cứu được tiến hành trước đây đó là ngoài 2 kiểu gen B và C đã được các nhóm tác giả tìm thấy, chúng tôi còn phát hiện được 14,86% số mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan B trong nghiên cứu thuộc kiểu gen A. Sự xuất hiện của kiểu gen A trong nghiên cứu của chúng tôi có thể là do sự lan truyền của kiểu virus này từ bên ngoài vào Việt Nam trong thời gian gần đây. Tuy nhiên, đây mới chỉ là giả thiết, để có thể xác định được nguồn gốc dịch tễ học phân tử của các chủng HBV có kiểu gen A này thì cần khảo sát sự lưu hành của kiểu gen này trên số mẫu lớn hơn và tại các khu vực khác của Việt Nam, cũng như tiến hành giải trình tự gen của kiểu gen A đã xác định.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
Nhóm nghiên cứu đã tách chiết HBV DNA với độ tinh sạch cao. Xác định được hàm lượng HBV DNA chính xác trên 74 mẫu HBV DNA bằng kỹ thuât Real-time PCR.
Nhóm đã ứng dụng thành công quy trình kỹ thuật Nested-PCR của Naito và cộng sự trong xác định kiểu gen của HBV ở 74 mẫu bệnh phẩm huyết thanh của bệnh nhân nhiễm virus HBV (có HBV-DNA (+)) tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu đã xác định được kiểu gen A chiếm 14,86%, kiểu gen B chiếm 50% và kiểu gen C chiếm 35,14%. Không tìm thấy kiểu gen D, E và F trong số các mẫu huyết thanh viêm gan B được nghiên cứu.
2. Đề nghị
Cần tiếp tục nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn, giải trình tự gen của các kiểu gen đã xác định, đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen của HBV với một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, tính kháng thuốc ở bệnh nhân nhiễm HBV.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt:
1. Đông thị Hoài An, Cao Minh Nga (2003), Kỹ thuật định típ gene siêu vi viêm gan B bằng Multiplex PCR trên bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mạn, Từ khoa học sinh học phân tử ñến cuộc sống và chăm sóc sức khỏe, tr. 17-25.
2. Bùi Đại (2002), Viêm gan vi rút B và D, Nhà xuất bản Y học.
3. Đỗ Đức Hiền (2010), Bệnh học lao và bệnh phổi, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 4. Bùi Hữu Hoàng (2002), Đặc điểm của dấu ấn huyết thanh và kiểu gene
của virus viêm gan B trên bệnh nhân xơ gan và ung thư gan, Luận văn tốt nghiệp trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh.
5. Bùi Hữu Hoàng, Đinh Dạ Lý Hương, Phạm Hoàng Phiệt, Erwin Sablon (2003), “Kiểu gen của siêu vi viêm gan B ở bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Chuyên đề Nội khoa, tập 7, phụ bản số 1:128-133.
6. Đặng Văn Khoa (2010), Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, đáp ứng miễn dịch, tính kháng thuốc ở bênh nhân lao phổi mới và lao phổi tái phát,