I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch
I.8.2. Công nghệ sản xuất kháng thểđơn dòng
Năm 1975 hai nhà khoa học là Kohler – Milstein đã đưa ra kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng ngoài cơ thể người dựa trên nguyên tắc lai tế bào u tủy (Myeloma) với tế bào lympho B đã hoạt hóa, sau này được các tác giả Karsten và Rudolph cải biên vào năm 1985. Qui trình, công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng.
Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng
Nguyên lý của qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies -mAb) (theo nguyên lý Kohler – Milstein, 1975): i) Tạo dòng tế bào lại hybridoma giữa tế bào lympho B và tế bào u tủy myeloma. ii) Nhân các tế bào lai phát triển để tạo thành một dòng tế bào mà sẽ sản xuất ra KTĐD mong muốn.
Tạo dòng tế bào lại hybridoma thực hiện qua các bước sau:
Bước 1: Gây kích ứng miễn dịch cho thú, thường là chuột BALB/c thuần chủng 3 tuần tuổi.
35
Sau một vài tuần gây miễn dịch các mẫu máu thu được từ chuột được định lượng kháng thể trong huyết thanh. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh được xác định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau ví dụ như ELISA hay đếm dòng tế bào. Nếu như hiệu giá kháng thể cao việc dung hợp tế bào có thể được thực hiện. Nếu như hiệu giá quá thấp người ta có thể áp dụng các phản ứng mạnh trên chuột cho đến khi hiệu giá đạt được đầy đủ ví dụ như lấy mẫu máu nhiều lần. Khi hiệu giá kháng thể đủ cao, chuột được thúc đẩy bằng cách tiêm kháng nguyên mà không có chất bổ trợ hoặc tiêm vào các tĩnh mạch (thông qua các tĩnh mạch đuôi) 3 ngày trước khi dung hợp và sau 2 tuần từ đợt gây miễn dịch trước đó. Sau đó những con chuột này được gây chết và tách lấy lá lách để sản xuất các tế bào hybridoma trong ống nghiệm.
Bước 3: Chuẩn bị các tế bào myeloma.
Tế bào lá lách sản xuất các tế bào dung hợp có tuổi thọ hạn chế so với các tế bào bất tử có nguồn gốc từ khối u của tế bào lympho (u tủy) cho kết quả là tạo ra các hybridoma có khả năng tăng trưởng không giới hạn. Tế bào myeloma là các tế bào bất tử đựơc nuôi cấy với 8-azaguanine để chắc chắn độ nhạy của nó với HAT, môi trường được lựa chọn sử dụng sau khi dung hợp tế bào. Một tuần sau khi dung hợp tế bào, tế bào myeloma được nuôi cấy trong 8-azaguanine. Các tế bào này phải có tính khả thi cao và tăng trưởng nhanh chóng. Môi trường HAT cho phép chỉ có các tế bào dung hợp mới tồn tại được.
Bước 4: Dung hợp tế bào myeloma với tế bào lá lách (tế bào lympho B). Tế bào lá lách đơn thu được từ các con chuột gây miễn dịch được dung hợp với các tế bào myeloma chuẩn bị trước. Quá trình dung hợp được thực hiện bằng đồng ly tâm thu các tế bào lá lách và tế bào myeloma trong polyethylene glycol, một chất có khả năng làm dung hợp màng tế bào. Như đã chú ý ở bước 3, chỉ có các tế bào dung hợp mới có khả năng phát triển trong môi trường chọn lọc đặc biêt. Các tế bào này sau đó được chia vào 96 giếng có các feeder cell lấy từ màng bụng của chuột. Trong các feeder cell này cung cấp các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của tế bào hybridoma. Các chế phẩm thương mại thu được là kết quả từ việc sưu tập các môi trường hỗ trợ cho việc nuôi cấy tế bào và có chứa sẵn các yếu tố tăng
36
trưởng có thể sử dụng thay thế cho các tế bào có nguồn gốc từ feeder cell chuột. Ngoài ra ta cũng có thể sử dụng tủy xương chuột tách từ tiểu thực bào như là các feeder cell.
Bước 5: Tạo dòng các tế bào hybridoma bằng “dung dịch pha loãng” hoặc nhân rộng và làm ổn định sản phẩm.
Ở bước mới này, các cụm nhỏ tế bào hybridoma từ 96 giếng cũng có thể phát triển trong nuôi cấy mô tế bào bằng các kháng nguyên gắn kết họặc phát triển theo phương pháp cổ chướng ở chuột với phương pháp nhân dòng ở thời gian sau. Tạo dòng bằng “dung dịch pha loãng” ở thời gian này đảm bảo chắc chắn rằng ít nhất mỗi giếng có chứa một dòng đơn. Trong một số trường hợp các kháng thể có thể tiết ra các chất độc hại cho các tế bào yếu đang được duy trì trong ống nghiệm. Việc tối ưu hóa phương pháp cổ chướng ở chuột trong giai đoạn này có thể cứu sống các tế bào. Ngoài ra kinh nghiệm của một số nhà nghiên cứu cho thấy rằng giai đoạn đầu cho các dòng tế bào phát triển theo phương pháp chuột cổ chướng sau đó cho phát triển trong điều kiện cơ thể hay điều kiện phòng thí nghiệm sẽ giúp tăng cường khả năng chịu đựng cũng như tối ưu hóa quá trình sản xuất kháng thể.
Nhân các tế bào lai phát triển để tạo thành dòng tế bàolai hybridoma:
Có hai phương pháp để phát triển các tế bào lai: i) Tiêm chúng vào khoang màng bụng của chuột các tế bào hybridoma sẽ nhân lên và sản xuất ra dịch lỏng (bệnh cổ trướng) ở bụng. Dịch lỏng này có chứa một nồng độ cao kháng thể. Sản xuất kháng thể bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột thì rẻ tiền, dễ thực hiện, và quen thuộc. Tuy nhiên, nếu tích tụ quá nhiều dịch lỏng hoặc nếu hybridoma là một bệnh ung thư độc, chuột sẽ trải qua đau đớn hoặc nguy hiểm. ii ) Sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro đây là một trong những giải pháp thay thế là gia tăng số lượng những tế bào hybridoma trong môi trường nuôi cấy tế bào. Kĩ thuật này yêu cầu một số kiến thức chuyên môn, những phương tiện, thiết bị đặc biệt, có thể tốn kém về mặt tiền bạc và mất nhiều thời gian. Hiện đã có một số nghiên cứu đáng kể trong kĩ thuật nuôi cấy tế bào in vitro cho sự phát triển hybridoma, và những phương pháp mới hơn này ít tốn kém hơn, nhanh hơn,và sản xuất kháng thể ở một nồng độ cao hơn so với những phương pháp trước đây.
37
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. Vật liệu nghiên cứu
II.1.1. Động vật thí nghiệm
Gà siêu trứng Ai Cập được cung cấp bởi Trang trại Gà giống Thụy Phương (Long Biên, Hà Nội), chuột BALB/c thuần chủng và tế bào Myeloma Sp2/0 do Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
II.1.2. Hóa chất và vật tư tiêu hao
BSA (bovine serum albumin) (Sigma). Các loại độc tố F1 gắn MBP; F1 tự nhiên, F1 thương mại. Các hóa chất dùng trong tạo cộng hợp: kháng thể đơn dòng G20 và kháng thể đơn dòng 3YP8; nano vàng 40 nm (Cytodiagnotics). Các loại dung dịch đệm: NaHCO3 0,1M pH 9,6; Borat 0,1M pH 8,5; PBS 0,01M pH 7,5. Các loại kháng thể và hóa chất dùng trong các thí nghiệm ELISA bao gồm: kháng thể phát hiện kháng IgY gắn HRP (Santa Cruz Biotechnology); cơ chất tetramethylbenzidine (TMB) (Promega); kháng thể phát hiện Ig. Các loại tá dược tiêm FCA (Freund’s complete adjuvant) và FIA (Freund’s incomplete adjuvant) (Sigma).
Các loại dụng cụ và vật tư tiêu hao: Màng thẩm tích 0,5ml 10 kDa (Thermo Scientific). Cột siêu lọc 100 kDa (Ultracell, Millipore). Đĩa vi giếng ELISA high binding (Costa). Màng nitrocellulose (Whatman), tấm lót plastic vinyl (Whatman), giấy thấm (Whatman), hạt nano vàng (Cytodiagnotics).
II.1.3. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng thuộc Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, bao gồm: Cân kỹ thuật; cân phân tích CPA 324S; máy Vortex Delta Mixer; máy ly tâm góp mẫu C1301B-230V; micropipet các loại; máy đo pH; hệ thống in phun que thử CAMAG-AUTOKUN; máy hút ẩm; máy đo nanodrop; lò lai phân tử; hệ thống đọc khay vi thể; tủ lạnh sâu -200C; tủ lạnh Heracus 40C; máy ly tâm Solval.
38
II.2. Phương pháp nghiên cứu
II.2.1. Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1
II.2.1.1 Tiêm Protein F1 tự nhiên gây đáp ứng miễn dịch trên gà
Gà được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm khoảng 2 tuần bắt đầu được tiêm gây đáp ứng miễn dịch. Trong thời gian này, các quả trứng được thu sẽ là trứng âm tính (IgY tinh sạch từ các trứng này sẽ không có khả năng đáp ứng miễn dịch với F1). Gà đang trong thời kỳ đẻ trứng sau đó sẽ được tiêm gây đáp ứng miễn dịch ở 2 vị trí trên ức với liều 0,2 mg F1 trong tổng thể tích 1 ml chứa 50% tá dược FCA (Freund’s complete adjuvant) trong ngày đầu tiên với tỉ lệ thể tích dịch cộng hợp trong PBS: thể tích “Freund’s complete adjuvant”- FCA (Sigma) là 3:1. Sau 20 ngày (ngày thứ 20), gà được tiêm nhắc lại lần thứ nhất với liều 0,1 mg F1 trong tổng thể tích 1 ml chứa 50% tá dược FIA (Freund’s incomplete adjuvant). Sau 15 ngày tiếp theo (ngày thứ 35), gà được tiêm nhắc lại lần thứ hai với liều lượng tương tự như lần tiêm nhắc lại thứ nhất. Trứng gà không tiêm cũng như trứng gà tiêm PBS và tá dược FCA/FIA cùng trứng gà ở các thời điểm sau khi tiêm được thu về và bảo quản ở điều kiện 4oC.
II.2.1.2 Tinh sạch IgY bằng phương pháp tủa PEG
Kháng thể IgY trong trứng gà được tách theo phương pháp kết tủa PEG [21]. Lòng đỏ sau khi được tách riêng khỏi lòng trắng sẽ được trộn với hai lần thể tích PBS rồi bổ sung 3,5% PEG 6000 (Sigma) (khối lượng/thể tích), đảo trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút, lắc 120 vòng/phút nhằm kết tủa các chất béo có trong lòng đỏ trứng. Ly tâm ở điều kiện 8000×g, 20 phút, 4oC sẽ giúp loại bỏ cặn chất béo, còn dịch nổi được lọc qua giấy thấm, và bổ sung 8,5% PEG 6000 (khối lượng/thể tích), đảo trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút, rồi ly tâm ở 8000×g, 20 phút, 4oC nhằm kết tủa IgY. Sau đó, kết tủa IgY được hòa tan trong 10 ml PBS rồi bổ sung 12% PEG 6000 (khối lượng/thể tích), đảo trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút rồi ly tâm ở 8000×g, 20 phút, 4oC nhằm kết tủa lại IgY. Sau đó, tiến hành hòa tan kết tủa thu được trong 3 ml PBS và siêu lọc ba lần bằng cột 100 kDa (Ultracell, Millipore) với PBS để thu nhận chế phẩm IgY tinh sạch. Chế phẩm IgY sau đó
39
được định lượng bằng cách đo OD ở bước sóng 280 nm và được kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE (12%) theo phương pháp của Laemmli.
II.2.1.3. Đánh giá hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ lòng đỏ trứng
A, Tạo kháng nguyên nang F1-MBP (Maltose binding protein)
Kháng nguyên F1-MBP được tạo làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY. Kháng nguyên F1-MBP được tạo ra bằng con đường tái tổ hợp. Sử dụng gene Caf1 mã hóa cho protein F1 được được nối với vectơ pET22 sử dụng để tạo ra một protein dung hợp có dạng MBP-F1- (His)10. Bên cạnh đó, đuôi ái lực (His)10 cũng được thêm vào ở đầu N nhằm tinh sạch nhờ sắc ký ái lực gắn Ni. Nội dung này đã được nghiên cứu trong một đồ án tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Văn Khanh, tác giả đã sản xuất thành công kháng nguyên này. Do vậy chúng tôi chỉ kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên trước khi sử dụng tiêm cho gà bằng phương pháp điện di biến tính protein SDS-PAGE trên gel polyacrylamide nồng độ 12%. Phương pháp điện di trên gel như sau:
Phương pháp điện di protein
Đổ gel: Lắp 2 phần bản kính vào giá đỡ, bổ sung nước vào giữa 2 bản kính để
kiểm tra độ dò nước.
Nếu có nước bị dò ra khỏi 2 phần bản kính thì điều chỉnh lại cho đến khi không bị dò nước nữa. Nếu không bị dò thì loại bỏ nước và tiến hành đổ gel.
Sau khi hòa trộn các hóa chất của thành phần gel tách với nhau bằng pippet một cách nhẹ nhàng, tiến hành nhả dung dịch gel tách vào giữa 2 phần bản kính, ước lượng khoảng cách phù hợp so với lược (gel tách cách lược 1cm là hợp lý).
Nhanh chóng bổ sung phần trống của bản kính bằng nước deion và đợi gel tách khô. Loại bỏ phần nước deion, tiến hành đổ gel cô.
Đặt lược thích hợp vào giữa 2 phần bản kính, có khe hở để nhả dung dịch vào trong.
Hòa trộn các hóa chất thành phần của gel cô với nhau, tiến hành đổ gel tương tự như đổ gel tách, tránh tạo bóng khí ở trong gel.
40
Chạy điện di: Lắp bản kính có chứa gel đã đông vào khung chạy điện di, và gắn vào bể chạy điện di theo đúng chiều dòng điện.
Đổ đầy Tank buffer vào giữa khung chạy điện di để kiểm tra có bị dò nước hay không. Nếu bị dò thì chỉnh lại bản kính trên khung chạy điện di.Bổ sung Tank buffer vào bể điện di theo mức được ghi chú trên thành bể.
Rút lược trên bản kính, bổ sung 15µl mẫu đã được xử lý và 4µl marker vào các giếng thích hợp.
Đậy nắp đúng chiều và tiến hành chạy điện di ở 15 mA (chạy 2 bản ở 25 mA) (bấm nút A để chạy bằng Ampe, điều chỉnh bằng nút mũi tên lên xuống, bấm nút RUN để tiến hành chạy điện di).
Sau khi mẫu chạy qua gel cô (marker bắt đầu tách băng) thì nâng cường độ dòng điện lên 25 mA (chạy 2 bản ở 45 mA) cho đến khi băng màu xanh chạy xuống đáy bản gel, bấm STOP và tắt máy để kết thúc quá trình chạy điện di.
Nhuộm gel:
Tách bản gel ra khỏi bản kính và tiến hành nhuộm bằng Staining buffer với lượng vừa đủ, tránh sáng, lắc trong 12 phút.
Đổ dịch nhuộm đã dùng vào chai chứa dịch nhuộm đã dùng.
Rửa bớt dịch nhuộm trên gel bằng nước máy, loại bỏ hết nước, bổ sung lượng Destaining vừa đủ, tránh sáng, lắc 20 phút.
Loại bỏ dịch tẩy và bổ sung dịch tẩy mới, tiếp tục lắc cho đến khi gel trong trở lại và các băng protein có thể nhìn thấy rõ ràng.
Tiến hành phân tích và chụp lại hình ảnh kết quả.
B, Phương pháp ELISA Xác định độ pha loãng kháng thể kháng IgY gắn enzym Horseradish peroxidase (HRP).
Chế phẩm IgY được cố định trên vi giếng, tiếp theo kháng thể phát hiện kháng IgY gắn enzym HRP được đưa vào giếng để tạo phức hợp (IgY)- (Anti IgY gắn Enzym HRP); cuối cùng cơ chất TMB được đưa vào giếng tạo sản phẩm có màu. Theo nguyên lý này, kháng thể IgY được cố định trên đĩa vi giếng bằng
41
NaHCO3 0,1 M ở các nồng độ 10, 30, 100 µg/ml ủ ở 37oC trong 2 giờ, pH 9,5. Quá trình khóa giếng được thực hiện như ở mục C. Tiếp đó rửa 3 lần với 300 µl đệm rửa/lần, bổ sung 100 µl cộng hợp kháng thể phát hiện kháng IgY gắn HRP với các nồng độ khảo sát là 1; 0,3; 0,1; 0,03 µg/100 µl (tương ứng hệ số pha loãng: 100 X, 300 X, 1000 X, 3000 X trong PBS có bổ sung BSA) và ủ trong 1 giờ ở 37oC. Tiếp theo, đĩa được rửa 5 lần với dung dịch rửa, và quá trình hiện màu được thực hiện như ở mục C.
C, Phương pháp ELISA Xác định độ pha loãng kháng chế phẩm IgY
Kháng nguyên F1 được cố định trên giếng, IgY được đưa vào giếng sẽ phản ứng với kháng nguyên F1 giữ lại trong giếng, tiếp đó kháng thể phát hiện kháng IgY gắn enzym HRP (Horseradish peroxidase) được thêm vào, cuối cùng cơ chất TMB (Tetramethylbenzidine) dưới sự chuyển hóa của enzym HRP (Horseradish peroxidase) tạo sản phẩm có màu. Sự xuất hiện màu phản ánh sự có mặt của IgY kháng F1. Theo nguyên lý này, đĩa vi giếng (Costa) được phủ bằng 100 µl kháng nguyên F1-MBP trong đệm NaHCO3 0,1 M (10 µg/ml) qua đêm ở 4oC, pH 9,5. Sau đó, những vị trí chưa liên kết trên giếng được phủ bằng 300 µl dung dịch PBS chứa 2% BSA trong 2 giờ ở 37oC. Tiếp theo, giếng được rửa 3 lần bằng 300 µl đệm rửa (PBS được bổ sung 0,05% (khối lượng/thể tích) Tween 20). Để đánh giá hiệu giá của kháng thể IgY được tạo ra sau khi gây đáp ứng miễn dịch, 100 µl IgY ở các độ pha loãng tới các nồng độ thích hợp khác nhau và được thêm vào mỗi giếng, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Sau 5 lần rửa với 300 µl đệm rửa, 100 µl cộng hợp kháng thể phát hiện kháng IgY gắn HRP (Santa Cruz Biotechnology) pha loãng tới nồng độ thích hợp (trong PBS có bổ sung BSA) được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 1 giờ ở 37oC. Tiếp theo, giếng được rửa 5 lần với dung dịch rửa, và 100 µl cơ chất tetramethylbenzidine (TMB) (Promega) được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 5