I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch
I.6.1. Phương pháp miễn dịch
I.6.1.1 Phương pháp ELISA kẹp đôi (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Sandwich)
Phương pháp này dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và các kháng thể (kháng thể bắt cặp và kháng thể phát hiện). Trong đó kháng thể bắt cặp được sử dụng là kháng thể đơn dòng hoặc kháng thể đa dòng, kháng thể phát hiện thường là kháng thể đơn dòng. Nguyên lý của phương pháp gồm: (1) gắn kháng thể bắt cặp lên giếng; (2) bổ sung mẫu (kháng nguyên liên kết với kháng thể bắt cặp); (3) bổ sung kháng thể phát hiện (kháng thể phát hiện sẽ liên kết với kháng nguyên); (4) bổ sung kháng thể cấp hai liên kết với enzym (kháng thể này liên kết với kháng thể phát hiện); (5) bổ sung cơ chất (nhằm chuyển hóa thành dạng có thể phát hiện được nhờ enzym).
26
Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu phản ánh nồng độ kháng nguyên cần phát hiện. Hiện nay, trên thế giới thường sử phương pháp ELISA kẹp đôi để phát hiện kháng thể kháng F1 trong huyết thanh hoặc các dịch tiết (nước bọt, nước tiểu). Ưu điểm cơ bản của các phương pháp ELISA kẹp đôi là có độ nhạy phát hiện cao và có khả năng định lượng. Nồng độ kháng thể kháng F1 tối thiểu có thể phát hiện được là 4 ng/ml. Độ nhạy là 90,1% đối với huyết thanh và 100% đối với dịch tiết như nước bọt. Phương pháp chẩn đoán kháng thể kháng F1 bằng ELISA thích hợp cho việc phát hiện sớm bệnh dịch hạch. Tuy nhiên, điểm hạn chế của các phương pháp này là đòi hỏi trang thiết bị cùng trình độ kỹ thuật cao để tránh hiện tượng dương tính giả và do đó chỉ thích hợp với các phân tích tại phòng thí nghiệm, không có khả năng ứng dụng tại hiện trường.
I.6.1.2. Sắc ký miễn dịch kẹp đôi
Phương pháp sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA) dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này được gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức hợp này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện (Hình 1.7). Đây là phương pháp phân tích nhanh, dễ thực hiện, được phát triển từ năm 1956. Trong 20 năm gần đây, nhờ ứng dụng công nghệ kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) và cải tiến nguyên liệu thành phần trong đó có việc sử dụng hạt nano kim loại làm thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng (Au) [14] và cải tiến chất lượng màng nitrocellulose (NC), cũng như ứng dụng tự động hóa trong sản xuất, ICA đã được ứng dụng để chế tạo nhiều sinh phẩm chẩn đoán các tác nhân gây bệnh khác nhau, bao gồm độc tố, dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh.Ưu điểm của sắc ký miễn dịch bao gồmtính đơn giản trong sử dụng, thời gian thực hiện nhanh, kết quả chính xác, giá thành rẻ, có thể dùng như một phương tiện lưu động, không cần máy móc quy mô và đắt tiền. Có thể sử dụng sắc ký miễn dịch để phát hiện kháng
27
nguyên hoặc kháng thể. Nguyên lý ứng dụng ICT sử dụng kháng thể phát hiện kháng nguyên được trình bày ở Hình 1.7.
Hình 1.7. Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II)
(Nguồn: Cortez Diagnostics, Inc.tại: http://www.rapidtest.com/) (Theo Nguyễn Đình Phúc và Lê Thanh Hòa, 2008)
+ Về thứ tự sắp xếp lắp ráp
Nguyên liệu gồm có: 1) tấm nhận mẫu; 2) tấm cộng hợp (conjugate); 3) vạch phát hiện T (test line); 4) vạch đối chứng C (control line); 5) tấm hút mẫu; 6) màng nitrocellulose; 7) khung đỡ bao bọc (Hình 1.7-I). Màng nitrocellulose, nối tấm cộng hợp với tấm hút mẫu, đảm bảo cho các phân tử vật chất chuyển động theo nguyên lý mao dẫn (Hình 1.7-II). Trên màng nitrocellulose bố trí vạch phát hiện T và vạch đối chứng C. Đầu cuối của bộ sinh phẩm có tấm hút để hút huyễn dịch khi bộ kit hoạt động. Tất cả được bao bọc bằng một khung nhựa tạo thành hộp, để hở ra bên ngoài là một giếng tra mẫu và một cửa sổ hình chữ nhật để đánh giá kết quả tại vạch T và C.
28
+ Về thành phần tham gia
Có 3 loại kháng thể: 1) Kháng thể 1 (KT1) là kháng thể đơn dòng kháng lại với một epitopecủa kháng nguyên cần phát hiện, sản xuất trên chuột; 2) Kháng thể 2 (KT2) là kháng thể với một epitope khác của cùng kháng nguyên cần phát hiện; 3) Kháng thể 3 (KT3) là kháng thể kháng lại IgG của loài sinh KT1, có khả năng kết hợp với bất kỳ kháng thể nào có bản chất cấu trúc là immunoglobulin IgG. Ngoài ra, thành phần tham gia kit còn có vật chất cộng hợp (conjugate), đó là hạt vàng (colloidal gold particle), được gắn vào với cấu trúc KT1. Tấm nhận mẫu được xếp gối lên trên tấm cộng hợp, rồi tấm cộng hợp được xếp chồng dính với màng nitrocellulose, tại tấm cộng hợp bố trí một lượng KT1 gắn cộng hợp với hạt vàng ở dạng khô; tại vạch T bố trí cố định KT2 ở dạng khô; và tại vạch C cũng được bố trí cố định KT3 cũng ở dạng khô, bình thường cả hai vạch này đều không nhìn thấy được (Hình 1.7-I).
+ Về nguyên tắc hoạt động của phép thử và đánh giá kết quả
Mẫu phân tích được xử lý bằng dịch chiết phù hợp rồi được nhỏ vào giếng S (sample) lên trên tấm nhận mẫu, về nguyên tắc, toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển dịch theo mao dẫn xuyên qua tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía tấm hút mẫu (Hình 1.7-II). Có 2 trường hợp kết quả sẽ xảy ra :
i) Nếu trong mẫu bệnh phẩm tra vào có kháng nguyên tương ứng (KN) thì
huyễn dịch mẫu bệnh phẩm sẽ tạo môi trường hoạt động cho KT1 + cộng hợp hạt vàng (KT1(Au)) và lúc này kháng nguyên sẽ kết hợp với một số phân tử (KT1(Au)) tạo thành phức hợp KT1(Au)+KN, tất cả đều cùng chuyển dịch đến vạch T. Tại vạch T, phức hợp này kết hợp tiếp với KT2 tạo thành phức hợp KT1(Au)+KN+KT2, hay nói cách khác KT2 cố định tại vạch T đã tóm bắt được kháng nguyên có ở phức hợp KT1(Au)+KN làm cho hạt vàng cộng hợp với KT1 tích tụ lại và hiển thị. Các phân tử (KT1(Au)) còn lại tiếp tục dịch chuyển đến vạch C, tại đây, phức hợp KT3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là kháng thể kháng lại IgG của chuột với KT1 có bản chất là IgG của chuột. Hạt vàng cộng hợp với KT1 cũng được tích tụ lại và hiển thị, về nguyên tắc, sự hiển thị này
29
bao giờ cũng được hình thành, cho dù bệnh phẩm có kháng nguyên hay không có kháng nguyên (Hình 1.7- II).
ii) Nếu trong mẫu tra vào không có kháng nguyên tương ứng (KN) thì huyễn
dịch dung môi trong mẫu bệnh phẩm vẫn sẽ hoạt hóa KT1 + cộng hợp vàng (KT1(Au)) và lúc này, do không có kháng nguyên để kết hợp với (KT1(Au)) nên phức hợp KN+KT1(Au) không được tạo thành. KT1(Au) đi xuyên qua vạch T mà không bị KT2 tóm bắt, nên tiếp tục chuyển dịch đến vạch C. Tại vạch C, phức hợp KT3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là kháng thể kháng lại IgG của chuột với KT1 có bản chất là IgG của chuột, có vai trò như là một kháng nguyên, do đó, hạt vàng cộng hợp với KT1 được tích tụ lại và hiển thị (Hình 1.7-II).
Như vậy: i) khi cả hai vạch T và C hiển thị thì kết quả đánh giá là dương tính và đã phát hiện sự có mặt của kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm; ii) khi chỉ có một mình vạch C hiển thị thì kết quả đánh giá là âm tính do trong mẫu bệnh phẩm không có mặt của kháng nguyên. Trường hợp cả hai vạch không hiển thị, phản ứng không được đánh giá và cần thiết phải làm lại. Không để phản ứng quá lâu (trên 30 phút) mới đánh giá, vì có thể phát sinh phản ứng phụ làm sai lệch kết quả.
Toàn bộ thời gian thực hiện phản tích chỉ khoảng 5-30 phút. Cho dù là kháng nguyên hòa tan (dạng polypeptide) hay kháng nguyên liên kết bề mặt của vi sinh vật, bộ sinh phẩm ICT đều cho phản ứng hoạt động chính xác. Do vậy, bộ sinh phẩm ICT được coi là công cụ thích hợp trongchẩn đoán sàng lọc các bệnh truyền nhiễm và phát hiện các độc tố độc chất, hóa chất, hóa dược [16].
Phương pháp sắc ký miễn dịch có ưu điểm nổi bật là thời gian phân tích ngắn, giá thành rẻ, quy trình thử nghiệm đơn giản không đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao, không cần thể tích mẫu lớn, là công cụ hữu hiệu cho phân tích nhanh ở hiện trường hoặc mục đích sàng lọc với số lượng mẫu lớn, có thể bảo quản lâu dài ở điều kiện thường. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như độ nhạy thấp hơn so với các phương pháp sắc ký dụng cụ hay ELISA, có khả năng phản ứng chéo với các độc tố có cấu trúc tương tự độc tố cần phân tích, có khả năng xảy ra hiện tượng âm tính hoặc dương tính giả [17].
30
Nghiên cứu đầu tiên phát triển que thử nhanh phát hiện kháng nguyên nang F1 được công bố trên tạp chí danh tiếng Lancet vào năm 2003. Bằng cách sử dụng hai kháng thể đơn dòng từ chuột, các tác giả đã tạo ra được que thử cho phép phát hiện F1 với ngưỡng rất thấp là 0,5 ng/ml trong vòng 15 phút. Cũng dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi nhưng Tsui và đồng tác giả (2015) lại sử dụng hai kháng thể đa dòng từ thỏ để phát hiện F1. Ngưỡng phát hiện F1 của que thử trong nghiên cứu này chỉ đạt ở mức 50 ng/ml ứng với 105CFU/ml của Y. pestis. Trên thị trường hiện cũng có một số loại sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch cho phép phát hiện nhanh Y. pestis như BADD Plague (Y. pestis) Biowarfare Detection Test Kit của công ty AdVnt Biotechnologies (ngưỡng phát hiện: 105CFU/ml, giá: 257 USD/10 test); Plague BioDetect™ Test Strips của công ty Alexeter Technologies; IMASS của công ty BBI cho phép phát hiện đồng thời 8 tác nhân vũ khí sinh học bao gồm Y. pestis (ngưỡng phát hiện: 108CFU/ml, giá:1200 USD/10 test); BioThreat Alert® Test Strips của công ty Tetracore (ngưỡng phát hiện: 105-6 CFU/ml, giá: 605 USD/25 test). Có thể nhận thấy rằng các bộ sinh phẩm thương mại có giá thành rất cao và ngưỡng phát hiện cũng ở mức trung bình khi so với công bố của Chanteau và đồng tác giả (2003).