SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) là một quá trình tổng hợp trong đó các aptamer được phân lập dựa trên các đặc tính chất lượng mong muốn. SELEX là một quy trình gồm nhiều bước. Trong đó các thụ thể liên kết tốt sẽ được chọn lọc qua nhiều vòng phân tích ái lực và khuếch đại bằng PCR
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 26
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.12:Quy trình phương pháp Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX)
Tóm tắt, quá trình SELEX bắt đầu từ một thư viện chứa các trình tự của oligonucleotide > 1015, chứa một vùng ngẫu nhiên được xác định bởi vùng 5’ và 3’ không đổi. Thư viện oligonucleotide được biến đổi thành các sợi DNA kép, và phiên mã ngoài tế bào để tạo một thư viện lớn các trình tự RNA. Mỗi trình tự RNA trong nhóm sẽ có một cấu trúc không gian 3 chiều đặc trưng. Các phân tử đích được bổ sung vào nhóm aptamer trong một dung dịch đệm có điều kiện phù hợp với phân tử đích. Nồng độ các ion hóa trị trong dung dịch đệm là quan trọng để tạo thành các cấu trúc axit nucleic bậc 2 và bậc 3. Trong chu kỳ chọn lọc đầu tiên, chỉ có một số aptamer gắn với đích, và phương pháp để chọn lọc các aptamer gắn đích và không gắn đích là rất cần thiết. Các aptamer gắn đích được rửa, phiên mã ngược và được khuếch đại bằng phương pháp PCR, kết quả tạo ra một thư viện DNA mới. Chu kỳ kế tiếp bắt đầu với thư viện này. Quá trình được lặp lại trong vài chu kỳ (thường là 8 – 12), chọn lọc các aptamer có ái lực và độ đặc hiệu ngày càng cao. Bước chọn lọc âm cũng rất quan trọng để thực hiện trong suốt quá trình SELEX, bởi vì có một phần rủi ro trong sự chọn lọc các aptamer không gắn đích. Sự chọn lọc và khuếch đại được
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 27
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
thực hiện thành công khi có một vài họ trình tự nổi trội trong sản phẩm khuếch đại. Các aptamer đã được chọn lọc này sau đó được tách dòng, giải trình tự và tiếp tục xác định đặc tính. Các aptamer DNA được chọn lọc theo cùng một cách thức, có sự loại bỏ enzyme phiên mã ngược và các sợi được tách ra trước khi hình thành cấu trúc không gian 3 chiều.
1.2.5.Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nƣớc
Với những ưu việt vượt trội của mình, aptamer đã và đang trở thành nhóm chất có nhiều tiềm năng, hy vọng trong nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, tạo cảm biến sinh học, điều trị ung thư, y dược, thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, thực phẩm…
Trong lĩnh vực chế tạo cảm biến sinh học: aptamer được sử dụng để phát hiện kháng sinh tồn dư trong sản phẩm như streptomycin, tobaramycin, neomycin. Aptamer được sử dụng để phát hiện độc tố nấm ở nồng độ nano gram: mycotoxin [10], ochratoxin A (OTA) và đã xây dựng thành kit thương phẩm, fumonisin B1 (FB1), nephrotoxin. Chúng còn được sử dụng để phát hiện các kim loại nặng có trong nước uống như arsen, thủy ngân trong cá, sữa. Aptamer RNA được sử dụng làm nền tảng để phát hiện các chất độc như Bisphenol A (BPA) tồn tại trong giấy gói thực phẩm, hộp bảo quản thức ăn, bình sữa (theo FDA 2010), melamin, thuốc trừ sâu: dư lượng Melachite Green (MG) trong cá, trứng, sữa.
Các kit thương phẩm của aptamer đã được thương mại hóa để nhận biết các phân tử: EGFR (ErbB1), INSR (Insulin Receptor), ErbB2, EphA2, IGF-1R, HGFR (c-MET)…
Aptamer được sử dụng cho việc sản xuất thuốc thương phẩm đầu tiên là sản phẩm: natri petaptanib dạng tiêm, tên thương phẩm Macugen của công ty Eyetech/Pfizer được cấp phép năm 2000. Đây là thuốc VEGF – 165 (yếu tố nội mô tăng trưởng mạch máu), giúp điều trị các bệnh lý ở mắt và tính thấm thành mạch để điều trị neovascularization liên quan đến thoái hóa điểm vàng do vấn đề tuổi tác. Chúng có bản chất là aptamer RNA kháng VEGF – 165 và các đồng vị chủ yếu của VEGF – 165. Từ đó, đã có nhiều thuốc dựa trên các nghiên cứu về aptamer được sử dụng trong điều trị bệnh như: AS1411, aptamer
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 28
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DNA liên kết đặc hiệu vưới neoleolin, dùng cho bệnh bạch cầu. ASRC1779, aptamer DNA liên kết đặc hiệu với willebrand, dùng cho hội chứng nghẽn động mạch vành cấp tính. NU172, DNA aptamer liên kết đặc hiệu thrombin, dùng hạn chế hình thành máu đông trong quá trình phẫu thuật tim mạch. Aptamer được nghiên cứu để sử dụng trong điều trị HIV. Các tác nhân gây bệnh AIDS là một retrovirus mà sử dụng vỏ glycoprotein (MT) gp160 để ràng buộc và lây nhiễm sang các tế bào T. Gp120 liên kết với các thụ thể tế bào T CD4 và một trong những chemokine đồng thụ là CCR5 hoặc CXCR4 và làm trung gian kết hợp giữa các hạt virus và máy chủ T-tế bào. Aptamer liên kết siRNAs hạn chế sự liên kết của gp120 với thụ thể của tế bào người để ngăn cản sự xâm nhập của virus
Ngoài ra, aptamer có rất nhiều ứng dụng trong điều trị ung thư: aptamer kháng tenascin – C (TN – C) có thể hạn chế phát triển khối u thân kinh đệm, u vú. TN – C là một protein ngoại bào (ECM) liên quan trong quá trình sửa chữa mô. Nó được biểu hiện quá mức trong chất nền của khối u tăng cường sự hình thành mạch tăng cường xâm lấn của khối u. Aptamer ức chế kháng nguyên màng cụ thể tuyến tiền liệt (PSMA) trong ung thư tuyến tiến liệt. PSMA là một loại metallopeptidase màng liên quan đến biểu hiện quá mức trên bề mặt của tế bào ung thư. PSMA cũng được biểu hiện trong các mạch máu của nhiều khối u rắn khác. Các aptamer để ức chế hoạt động enzyme (N-acetyl-α liên kết dipeptidase) của PSMA. Hướng nghiên cứu đề xuất là các aptamer kháng PSMA mang siRNA gắn với các tế bào biểu hiện PSMA để ức chế khối u.
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 29
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 1.13. Hoạt động của aptasensor điện hóa
A-Các hạt Pt có chức năng aptamer được dùng như xúc tác khử điện hóa H2O2 và tạo tín hiệu khuếch đại đối tượng đích. B-các hạt vàng có gắn aptamer chứa đuôi poly A được sử dụng làm đầu dò nhận biết. Adenine được giải phóng sẽ được xác định để tạo ra các tín hiệu khuếch đại. C-bộ phận tiếp nhận, trình tự mồi aptamer sắp xếp trong phản
ứng theo chu kỳ để tăng cường tín hiệu.
Ở Việt Nam hiện nay, aptamer là lĩnh vực nghiên cứu mới và đã có một số nghiên cứu, ứng dụng: nghiên cứu tạo aptamer tái tổ hợp đặc hiệu tế bào ung thư máu dạng Lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị. Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đang tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất chế tạo và sử dụng bộ kit phát hiện kháng sinh trong sữa bằng kỹ thuật nano (sử dụng aptamer). Nghiên cứu tổng hợp các aptamer ức chế protease HIV của đại học Khoa học tự nhiên. Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng đang tiến hành các nghiên cứu ứng dụng aptamer và vật liệu naono trong: phát hiện tồn dư của thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản, các ion kim loại nặng… trong sản phẩm nông nghiệp và môi trường. Hiện nay, đại học Bách Khoa Hà Nội cũng tập trung phát triển biosensor hệ điện cực cấu trúc răng lược-FET để chế tạo các cảm biến DNA như xác định virus viêm não Nhật Bản, virus cúm A…[1,14,15]
Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 30
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU *** ***
2.1. Nguyên vật liệu
- Thư viện ADN sợi đơn với 1015
phân tử có trình tự
5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N40 – AAG CTT TGG TGT T – 3’
- Cặp mồi dùng để nhân bản đoạn gen:
ApF2: 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’; ApR2: 5’ – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’; ApF2SH: 5’ – SH – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’; ApR2B: 5’ – Biotin – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC –3’;
ApF2B: 5’ – Biotin – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’ (Macrogen); - Hạt từ Dynabeads MyOne Streptavidin (Invitrogen).
- Cộng hợp Streptomycin – Agarose 4B;
- Cộng hợp BSA-Streptomycin được mua của công ty Imgen Bio Science, Inc; - Enzyme lamda exonuclease (BioLabs)
- Kháng sinh streptomycin tự do và một số hóa chất tinh khiết khác được mua của Sigma, Merch.
- Vector tách dòng pCR2.1-TOPO (Invitrogen) và dòng tế bào vi khuẩn E.coli chủng DH5α phục vụ cho việc tách dòng aptamer;
- Cộng hợp Streptavidin-enzyme hydroxyperoxydase (Invitrogen). - Chip vàng nano (Nhật Bản), K4Fe(CN)6, K3Fe(CN)6, KCl, BSA, …
- Các loại hóa chất khác: DMSO, EDTA, EtBr, LB, MPBS, TAE, TMB, TPBS, SDS, X-gal, H2SO4,….