3.1.1.1. Kết quả đánh giá lựa chọn vùng bảo thủ trên gen đích nad1 sử dụng để thiết kế mồi LAMP
Sử dụng công cụ tìm kiếm trình tự gen nad1 của C. sinensis và BLAST trình tự nucleotide trên ngân hàng dữ liệu NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) để tìm kiếm các trình tự gen tương đồng. Kết quả cho thấy có tổng số 24 trình tự gen nad1 công bố trên NCBI là chủng C. sinensis từ Trung Quốc và Hàn Quốc và Việt Nam. Độ
tương đồng trình tự giữa các phân lập được công bố trên NCBI từ 99,07% đến 100%.
Hình 3.1.Kết quả tìm kiếm trình tự gen nad1 của C. sinensis trên NCBI
Các trình tự được tải về và được phân tích so sánh gióng hàng bằng thuật toán ClustalW Multiple Alignment của phần mềm ioedit v.2.7.6 để xác định vùng bảo thủ. Vùng trình tự bảo thủ được sử dụng để thiết kế bộ mồi LAMP bằng phần mềm trực tuyến PrimerExproler V5.
Hình 3.2. Ảnh phân tích gióng h ng 24 trình tự gen nad1 của C. sinensis bằng phần mềm Bioedit v.2.6.7
3.1.1.2.Kết quả thiết kế mồi LAMP trên vùng bảo thủ trên gen đích nad1 và đánh giá độ đặc hiệu lý thuyết
Khác với kỹ thuật PCR, phản ứng LAMP cần tối thiểu 4 mồi gồm F3 (mồi xuôi ngoài), B3 (mồi ngược ngoài), FIP (mồi xuôi trong) và BIP (mồi ngược trong). Để tăng tốc độ phản ứng, người ta có thể dùng thêm các mồi bắt cặp với vùng vòm được gọi là LF (Loop forward hay mồi vòm xuôi) và LB (Loop backward hay mồi vòm ngược). Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế phản ứng LAMP với 4 mồi là F3, B3, FIP và BIP.
Sử dụng phần mềm PrimerExproler V5với vùng trình tự bảo tồn của gen
nad1 lựa chọn để thiết kế mồi LAMP. Các bộ mồi được lựa chọn theo một số tiêu
chí chính đã được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng phần mềm PrimerExproler V5 bao gồm Tm của F1c và B1c khoảng 650C (64 – 660C); Tm của F2, B2, F3 và B3 khoảng 600C (59 – 610C). Yêu cầu về tỷ lệ GC trong mồi dao động từ 40% đến 65%. Mồi được lựa chọn phải ít có khả năng tạo cấu trúc bậc 2. Kiểm tra độ đặc hiệu lý thuyết của các mồi bằng công cụ Blast của NC I để đảm bảo các bộ mồi có
độ đặc hiệu cao với gen đích. Dựa vào các tiêu chí trên, 2 bộ mồi được lựa chọn (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Trình tự mồi LAMP đƣợc thiết kế để khuếch đại gen nad1
Tên mồi Trình tự (5’-3’) CS-Nad1-F3 CS-Nad1-B3 CS-Nad1-FIP CS-Nad1-BIP CTCATGATGGTGGGTGTG CCAAAGCGCATATTATAACAATG CAACCCTTAAAACCCTATAACCAGTTTTGTTCAGTGACGCTTTTGTG GTTGGGGGTCGTATAAAAAGTTTGTTTTAAAACAGGCCTCGAATGT TCS-Nad1-F3 TCS-Nad1-B3 TCS-Nad1-FIP TCS-Nad1-BIP GTTCAGTGACGCTTTTGTG GTAATCACCACACACCAAAG TATACGACCCCCAACCAACCTTTTGTTGCTTTTAATTACTAGGTTGAC AAGTTTGCTCTTATAAGTTGTGTGCTTTTAATGCACATAAAACAGGCC
Các bộ mồi được lựa chọn đều đáp ứng các tiêu chí về Tm đối với thiết kế mồi. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu lý thuyết của các mồi bằng công cụ Blast của NCBI cho thấy các bộ mồi đều bắt cặp đặc hiệu 100% với trình tự gen nad1 được
công bố trên NCBI và không lai chéo với trình tự của các loài sinh vật khác. Chúng tôi sử dụng 2 bộ mồi này để sàng lọc, lựa chọn bộ mồi có độ nhạy cao hơn.
3.1.1.3. Kết quả lựa chọn và đánh giá độ đặc hiệu của mồi LAMP bằng thực nghiệm
Kết quả lựa chọn bộ mồi LAMP có độ nhạy tốt nhất:
Để lựa chọn được bộ mồi cho độ nhạy cao hơn và không lai chéo với loài sán lá gan nhỏ khác ở Việt Nam là O. viverrini, chúng tôi đã thực hiện các phản ứng
LAMP với hai bộ mồi thiết kế, sử dụng mẫu ADN tổng số tách chiết từ con sán lá gan nhỏ trưởng thành C. sinensis, được pha loãng ở 3 nồng độ khác nhau 1 ng/µl, 100 pg/µl và 10 pg/µl và 01 mẫu ADN của O. viverrini. Đánh giá hiệu quả khuếch đại của các bộ mồi bằng điện di trên gel agarose 2% (Hình 3.3).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
CS-Nad1 TCS-Nad1
Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả thử nghiệm các mồi LAMP thiết kế dựa trên khả năng tổng hợp ADN
1, 12: Ladder 100 bp
2, 7: ADN của O. viverrini(10 pg/µl)
3,4,5:ADN của C. sinensis với các nồng độ 1 ng/µl, 100 pg/µl và 10 pg/µl với bộ mồi CS-Nad1
6, 11: Chứng âm (nước khử ion)
8,9,10 ADN của C. sinensis với các nồng độ 1 ng/µl, 100 pg/µl và 10 pg/µl với bộ mồi TCS-Nad1
Kết quả thí nghiệm cho thấy bộ mồi CS-Nad1có độ nhạy cao hơn, cho sản phẩm khuếch đại ADNđối với sán lá gan nhỏC. sinensis ở cả 3 nồng độ mẫu thử nghiệm, bộ mồi TCS-Nad1 chỉ cho sản phẩm khuếch đại ở 2 nồng độ mẫu thử nghiệm. Hai bộ mồi đều không lai chéo với sán lá gan nhỏ loài O. viverrini. Do vậy, bộ mồi CS-Nad1 được lựa chọn để tiếp tục khảo sát độ đặc hiệu bằng thực nghiệm.
Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của mồi F3/B3 bằng kỹ thuật PCR:
Sử dụng cặp mồi ngoài F3, B3 của bộ mồi LAMP thiết kế với ký hiệu CS- Nad1 để khảo sát độ đặc hiệu với C. sinensis. Thực hiện phản ứng PCR nhân bản vùng gen đích nad1 với mẫu ADNkhuôn được tách từ sán lá gan nhỏ C. sinensis
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F3/B3 của C. sinensis
Giếng 1, 6: Ladder 100 bp
Giếng2,3,4: AND khuôn của C. sinensis với nồng độ 1 ng/µl, 100 pg/µl, 10 pg/µl Giếng 5: Chứng âm (nước khử ion)
Kết quả PCR cho thấy cặp mồi CS-nad1 F3/B3 cho sản phẩm khuếch đại đặc hiệu với sán lá gan nhỏ C. sinensis, với kích thước band ADN thu được đúng theo thiết kế là 192 bp.
Kết quả giải trình tự ADN đoạn gen nad1 đƣợc khuếch đại bằng mồi
CS-Nad1-F3/B3:
Sản phẩm PCR được khuếch đại bằng cặp mồi CS-Nad1-F3/B3 được giải trình tự trên máy ABI 3500 (Hình 3.5).
Hình 3.5. Ảnh giản đồ trình tự ADN của đoạn gen nad1 đƣợc nhân bản với cặp mồi CS-Nad1-F3/B3 với mẫu C. sinnensis tại Ninh Bình
1 2 3 4 5 6
Khi phân tích trình tựADN thu được với các trình tự gen nad1 của C. sinensis
được công bố trên NCBI cho thấy có độ tương đồng 100%. Kết quả này khẳng định cặp mồi CS-Nad1-F3/ 3 đã bắt cặp đặc hiệu với gen nad1 của C. sinensis.
Kết quả đánh giá khả năng lai chéo của mồi thiết kế với một số loài giun sán khác:
Thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi CS-nad1-F3, CS-nad1-B3 trên mẫu ADN của một số loài giun sán khác nhau bao gồm sán lá gan nhỏ (O.
viverrini), sán lá ruột nhỏ (Haplorchis pumilio, H. taichui), Paragonimus heterotremus, sán lá gan lớn (Fasicola gigatica)và giun đũa (Ascaris lumbricoide).
Kết quả điện di sản phẩm PCR thể hiện ở Hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CS-Nad1-F3/B3 trên các mẫu thử nghiệm l ADN của một số lo i giun, sán.
1, 10: Ladder 100 bp
2: O. viverrini 3: C.sinensis 4: Haplorchis pumilio 5: H. taichui 6: Paragonimus heterotremus
7: Fasicola gigatica 8: Ascaris lumbricoide 9: Chứng âm
Kết quả PCR với cặp mồi thiết kế CS-nad1 F3/B3 cho band đặc hiệu cho sán lá gan nhỏ C. sinensis và không bắt cặp lai chéo với các loài giun sán thử nghiệm khác.
Từ những kết quả trên cho thấy bộ mồi thiết kế CS-Nad1 đáp ứng được các yêu cầu về lý thuyết và thực nghiệm đối với một bộ mồi LAMP, được chúng tôi lựa
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
chọn để tối ưu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người.
3.1.2. Kết quả tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP xác định C. sinensis 3.1.2.1. Kết quả khảo sát tối ưu nhiệt độ ủ mồi cho phản ứng LAMP
Nhiệt độ ủ của phản ứng LAMP ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Bst
ADN polymerase, ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp mồi với trình tự gen đích. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme Bst DNA polymerase theo khuyến cáo của nhà sản xuất là ở 650C. Tuy nhiên, tùy thuộc vào trình tự các bộ mồi thiết kế mà có sự điều chỉnh nhiệt độ tối ưu. Các phản ứng LAMP được thực hiện giống nhau về thành phần hóa chất tham gia theo hướng dẫn của nhà sản xuất enzyme, sử dụng ADN khuôn tách từ sán lá gan nhỏ C. sinensis với cùng nồng độ10pg/µl, thay đổi về nhiệt độ ủ của phản ứng bằng gradient nhiệt độ từ 590C đến 680C, thời gian phản ứng là 60 phút. Sản phẩm của phản ứng LAMP được điện di trên gel agarose 2% (Hình 3.7).
Hình 3.7. Ảnh điện di kết quả khảo sát nhiệt độ ủ của phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp
Giếng 1-12:Phản ứng LAMP ở với gradient nhiệt độ bắt cặp mồi từ 59-680C Giếng 5-8: nhiệt độ từ từ 620C đến 650C.
Kết quả khảo sát cho thấy phản ứng LAMP cho sản phẩm khuếch đại ở dải nhiệt độ từ 620C đến 650C, trong đó ở nhiệt độ ủ 630
phẩm với các băng rõ ràng nhất. Nhiệt độ ủ của phản ứng ở 630C nằm trong khoảng enzyme cho hoạt tính tốt theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Kết quả này cũng tương tự như quy trình được nhóm tác giả Le.T.H và cộng sự sử dụng là nhiệt độ 630C và thu được các băng điển hình của O.viverrini trên gel agarose [31].
Nhóm tác giả Chen và cộng sự nghiên cứu đã tối ưu phản ứng LAMP ở nhiệt độ từ 60 đến 650C trong vòng một giờ và tại các điều kiện nhiệt độ này đều cho thấy hình ảnh các băng ADN của C.sinensis trên agarose [17].
3.1.2.2. Kết quả khảo sát tối ưu thời gian của phản ứng LAMP
Ưu điểm của LAMP so với các kỹ thuật PCRlà thời gian phản ứng ngắn hơn, với phản ứng LAMP thông thường nằm trong khoảng từ 30-60 phút. Nghiên cứu này thực hiện khảo sát thời gian phản ứng LAMP với các mốc thời gian 30 phút, 45 phút, 60 phút và 75 phút. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8.Kết quả khảo sát thời gian của phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp
1, 3, 5, 7: Chứng âm (nước khử ion)
2: Thời gian ủ trong 30 phút 4: Thời gian ủ trong 45 phút 6: Thời gian ủ trong 60 phút 8: Thời gian ủ trong 75 phút
Kết quả khảo sát thời gian ủ của phản ứng LAMP cho thấy sản phẩm khuếch đại ở thời gian 60 phút và 75 phút với lượng ADN đủ để phát hiện sản phẩm, các
băng mục tiêu chính xác, rõ nét. Kết quả này của chúng tôi đưa ra thời gian thực hiện ngắn hơn trong quy trình được nhóm tác giả Le.T.H và cộng sự sử dụng. Trong nghiên cứu này nhóm đã thao tác với thời gian là 70 phút [31].
Chen và cộng sự khi thực hiện phản ứng LAMP ở các khoảng thời gian 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút cho kết quả các băng ADN của C.sinensis rõ nét trên agarose ở các khoảng thời gian 45, 60 và 75 phút [18].
Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ của phản ứng LAMP là 60 phút.
3.1.2.3. Kết quả khảo sát tối ưu nồng độ Mg2+ của phản ứng LAMP
Phản ứng LAMP tạo ra sản phẩm là các đoạn ADN-vòm có kích thước lớn nên thường cần lượng Mg2+ lớn hơn so với phản ứng PCR thông thường. Tiến hành khảo sát phản ứng LAMP ở các nồng độ MgSO4 là 4mM, 6mM, 8mM và 10 mM với điều kiện nhiệt độ ủ là 630C và thời gian ủ của phản ứng LAMP là 60 phút. Kết quả điện di sản phẩm LAMP được thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9.Kết quả khảo sát tối ƣu nồng độ Mg2+cho phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp 1, 3, 5, 7: Chứng âm 2: Sản phẩm LAMP ở nồng độ MgSO4 4 mM 4: Sản phẩm LAMP ở nồng độ MgSO4 6 mM 6: Sản phẩm LAMP ở nồng độ MgSO4 8 mM 8: Sản phẩm LAMP ở nồng độ MgSO4 10 mM L 1 2 3 4 5 6 7 8
Nồng độ MgSO4 có ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN của phản ứng LAMP. Kết quả khảo sát cho thấy ở nồng độ MgSO4 8mM phản ứng LAMP cho kết quả băng mục tiêu chính xác, rõ nét nhất. Do vậy nồng độ MgSO4 8mM được chọn là tối ưu cho phản ứng LAMP xác định C. sinensis. Kết quả này phù hợp với nồng độ MgSO4 theo khuyến cáo sử dụng của nhà sản xuất enzyme và có sự tương đồng với nhiều quy trình được các nhóm tác giả khác nghiên cứu [39]. Trong khi Le.T.H và cộng sự sử dụng MgSO4 16mM [26]; Chen và cộng sự sử dụng nồng độ MgSO4 4mM cũng cho các băng ADN của C.sinensis rõ nét trên agarose[14].
3.1.2.4. Kết quả khảo sát tối ưu nồng độ mồi của phản ứng LAMP
Cặp mồi F3/B3 có vai trò thực hiện giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu cho phản ứng LAMP. Cặp mồi FIP/BIP có vai trò thực hiện giai đoạn khuếch đại phản ứng LAMP. Thực hiện khảo sát phản ứng LAMP với 5 nồng độ mồi hỗn hợp khác nhau:
Nồng độ mồi mix A: F3/B3 nồng độ 0,12 µM, FIP/BIP nồng độ 1,6 µM Nồng độ mồi mix B: F3/B3 nồng độ 0,16 µM, FIP/BIP nồng độ 1,6 µM Nồng độ mồi mix C: F3/B3 nồng độ 0,2 µM, FIP/BIP nồng độ 0,8 µM Nồng độ mồi mix D: F3/B3 nồng độ 0,2 µM, FIP/BIP nồng độ 1,2 µM Nồng độ mồi mix E: F3/B3 nồng độ 0,2 µM, FIP/BIP nồng độ 1,6 µM
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng LAMP khảo sát nồng độ mồi được thể hiện ở hình 3.10
Hình 3.10. Kết quả khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp 1, 3, 5, 7: Chứng âm
2, 4, 6, 8, 10: Sản phẩm LAMP với các nồng độ mồi mix A, B, C, D, E
A B C D E
Nồng độ mồi ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN của phản ứng LAMP. Kết quả khảo sát nồng độ mồi cho thấy hỗn hợp mồi E với nồng độ mồi F3/B3 là 0,2 µM, FIP/BIP là 1,6 µM cho hiệu suất tổng hợp tốt nhất, là tối ưu cho phản ứng LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis. Kết quả này của chúng tôi tương tự như quy trình được nhóm tác giả Rahman và cộng sự. Trong nghiên cứu này nhóm đã thao tác ở nồng độ mồi: 0,2 µM mồi F3/B3; 1,6 µM mồi FIP/ IP và thu được các băng điển hình của C.sinensis trên gelagarose [39].
3.1.2.5. Kết quả khảo sát tối ưu nồng độ dNTP mix của phản ứng LAMP
Đối với phản ứng LAMP lượng dNTP mix được sử dụng với nồng độ cao hơn nhiều so với phản ứng PCR nên việc tối ưu nồng độ nhỏ nhất để không sử dụng thừa và tiết kiệm hóa chất là cần thiết. Thực hiện phản ứng LAMP với 3 nồng độ dNTP mix đưa vào phản ứng là 0,6 mM, 1,0 mM và 1,4 mM. Kết quả khảo sát thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11.Kết quả khảo sát nồng độ dNTP mix cho phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp 1, 3, 5: chứng âm (nước khử ion)
2, 4, 6: Sản phẩm LAMP với nồng độ dNTP mix là 0,6 mM; 1,0 mM và 1,4 mM Nồng độ dNTP mix ở 1,4 mM có hiệu suất khuếch đại sản phẩm cao hơn các nồng độ dNTP mix thấp. Kết quả này của chúng tôitương đồng nồng độ dNTP trong quy trình được nhóm tác giả Rahman và cộng sự sử dụng, với nồng độ dNTP mix là
1,4 mM và nhóm nghiên cứu thu được các băng điển hình của C.sinensis trên gelagarose [39].
3.1.2.6. Kết quả khảo sát tối ưu thể tích ADN tổng số đưa vào phản ứng LAMP
Mẫu phân chứa rất nhiều vi sinh vật và cũng như các tế bào khác nhau, hơn nữa lượng trứng có trong mẫu phân thường thấp. Việc khảo sát lượng mẫu ADN tổng số đưa vào phản ứng LAMP là cần thiết để phản ứng LAMP không bị ức chế, đồng thời tăng khả năng phát hiện được ADN của sán lá gan nhỏ có trong mẫu phân. Kết quả khảo sát lựa chọn lượng ADN đưa vào phản ứng cho phản ứng LAMP chẩn đoán xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis được trình bầy ở (Hình 3.12).
Hình 3.12. Kết quả khảo sát thể tíchADN khuôn đƣa v o phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp
Giếng 1: Chứng âm (nước khử inon)
Giếng 2: Phản ứng LAMP với thể tích ADN khuôn 2µl Giếng 3: Phản ứng LAMP với thể tích ADN khuôn 3µl Giếng 4: Phản ứng LAMP với thể tích ADN khuôn 4µl Giếng 5: Phản ứng LAMP với thể tích ADN khuôn 5µl
Trong thử nghiệm này, lượng ADN khuôn đưa vào phản ứng tạo sản phẩm