Giếng 1-12:Phản ứng LAMP ở với gradient nhiệt độ bắt cặp mồi từ 59-680C Giếng 5-8: nhiệt độ từ từ 620C đến 650C.
Kết quả khảo sát cho thấy phản ứng LAMP cho sản phẩm khuếch đại ở dải nhiệt độ từ 620C đến 650C, trong đó ở nhiệt độ ủ 630
phẩm với các băng rõ ràng nhất. Nhiệt độ ủ của phản ứng ở 630C nằm trong khoảng enzyme cho hoạt tính tốt theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Kết quả này cũng tương tự như quy trình được nhóm tác giả Le.T.H và cộng sự sử dụng là nhiệt độ 630C và thu được các băng điển hình của O.viverrini trên gel agarose [31].
Nhóm tác giả Chen và cộng sự nghiên cứu đã tối ưu phản ứng LAMP ở nhiệt độ từ 60 đến 650C trong vòng một giờ và tại các điều kiện nhiệt độ này đều cho thấy hình ảnh các băng ADN của C.sinensis trên agarose [17].
3.1.2.2. Kết quả khảo sát tối ưu thời gian của phản ứng LAMP
Ưu điểm của LAMP so với các kỹ thuật PCRlà thời gian phản ứng ngắn hơn, với phản ứng LAMP thông thường nằm trong khoảng từ 30-60 phút. Nghiên cứu này thực hiện khảo sát thời gian phản ứng LAMP với các mốc thời gian 30 phút, 45 phút, 60 phút và 75 phút. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8.Kết quả khảo sát thời gian của phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp
1, 3, 5, 7: Chứng âm (nước khử ion)
2: Thời gian ủ trong 30 phút 4: Thời gian ủ trong 45 phút 6: Thời gian ủ trong 60 phút 8: Thời gian ủ trong 75 phút
Kết quả khảo sát thời gian ủ của phản ứng LAMP cho thấy sản phẩm khuếch đại ở thời gian 60 phút và 75 phút với lượng ADN đủ để phát hiện sản phẩm, các
băng mục tiêu chính xác, rõ nét. Kết quả này của chúng tôi đưa ra thời gian thực hiện ngắn hơn trong quy trình được nhóm tác giả Le.T.H và cộng sự sử dụng. Trong nghiên cứu này nhóm đã thao tác với thời gian là 70 phút [31].
Chen và cộng sự khi thực hiện phản ứng LAMP ở các khoảng thời gian 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút cho kết quả các băng ADN của C.sinensis rõ nét trên agarose ở các khoảng thời gian 45, 60 và 75 phút [18].
Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ của phản ứng LAMP là 60 phút.
3.1.2.3. Kết quả khảo sát tối ưu nồng độ Mg2+ của phản ứng LAMP
Phản ứng LAMP tạo ra sản phẩm là các đoạn ADN-vòm có kích thước lớn nên thường cần lượng Mg2+ lớn hơn so với phản ứng PCR thông thường. Tiến hành khảo sát phản ứng LAMP ở các nồng độ MgSO4 là 4mM, 6mM, 8mM và 10 mM với điều kiện nhiệt độ ủ là 630C và thời gian ủ của phản ứng LAMP là 60 phút. Kết quả điện di sản phẩm LAMP được thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9.Kết quả khảo sát tối ƣu nồng độ Mg2+cho phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp 1, 3, 5, 7: Chứng âm 2: Sản phẩm LAMP ở nồng độ MgSO4 4 mM 4: Sản phẩm LAMP ở nồng độ MgSO4 6 mM 6: Sản phẩm LAMP ở nồng độ MgSO4 8 mM 8: Sản phẩm LAMP ở nồng độ MgSO4 10 mM L 1 2 3 4 5 6 7 8
Nồng độ MgSO4 có ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN của phản ứng LAMP. Kết quả khảo sát cho thấy ở nồng độ MgSO4 8mM phản ứng LAMP cho kết quả băng mục tiêu chính xác, rõ nét nhất. Do vậy nồng độ MgSO4 8mM được chọn là tối ưu cho phản ứng LAMP xác định C. sinensis. Kết quả này phù hợp với nồng độ MgSO4 theo khuyến cáo sử dụng của nhà sản xuất enzyme và có sự tương đồng với nhiều quy trình được các nhóm tác giả khác nghiên cứu [39]. Trong khi Le.T.H và cộng sự sử dụng MgSO4 16mM [26]; Chen và cộng sự sử dụng nồng độ MgSO4 4mM cũng cho các băng ADN của C.sinensis rõ nét trên agarose[14].
3.1.2.4. Kết quả khảo sát tối ưu nồng độ mồi của phản ứng LAMP
Cặp mồi F3/B3 có vai trò thực hiện giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu cho phản ứng LAMP. Cặp mồi FIP/BIP có vai trò thực hiện giai đoạn khuếch đại phản ứng LAMP. Thực hiện khảo sát phản ứng LAMP với 5 nồng độ mồi hỗn hợp khác nhau:
Nồng độ mồi mix A: F3/B3 nồng độ 0,12 µM, FIP/BIP nồng độ 1,6 µM Nồng độ mồi mix B: F3/B3 nồng độ 0,16 µM, FIP/BIP nồng độ 1,6 µM Nồng độ mồi mix C: F3/B3 nồng độ 0,2 µM, FIP/BIP nồng độ 0,8 µM Nồng độ mồi mix D: F3/B3 nồng độ 0,2 µM, FIP/BIP nồng độ 1,2 µM Nồng độ mồi mix E: F3/B3 nồng độ 0,2 µM, FIP/BIP nồng độ 1,6 µM
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng LAMP khảo sát nồng độ mồi được thể hiện ở hình 3.10
Hình 3.10. Kết quả khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp 1, 3, 5, 7: Chứng âm
2, 4, 6, 8, 10: Sản phẩm LAMP với các nồng độ mồi mix A, B, C, D, E
A B C D E
Nồng độ mồi ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN của phản ứng LAMP. Kết quả khảo sát nồng độ mồi cho thấy hỗn hợp mồi E với nồng độ mồi F3/B3 là 0,2 µM, FIP/BIP là 1,6 µM cho hiệu suất tổng hợp tốt nhất, là tối ưu cho phản ứng LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis. Kết quả này của chúng tôi tương tự như quy trình được nhóm tác giả Rahman và cộng sự. Trong nghiên cứu này nhóm đã thao tác ở nồng độ mồi: 0,2 µM mồi F3/B3; 1,6 µM mồi FIP/ IP và thu được các băng điển hình của C.sinensis trên gelagarose [39].
3.1.2.5. Kết quả khảo sát tối ưu nồng độ dNTP mix của phản ứng LAMP
Đối với phản ứng LAMP lượng dNTP mix được sử dụng với nồng độ cao hơn nhiều so với phản ứng PCR nên việc tối ưu nồng độ nhỏ nhất để không sử dụng thừa và tiết kiệm hóa chất là cần thiết. Thực hiện phản ứng LAMP với 3 nồng độ dNTP mix đưa vào phản ứng là 0,6 mM, 1,0 mM và 1,4 mM. Kết quả khảo sát thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11.Kết quả khảo sát nồng độ dNTP mix cho phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp 1, 3, 5: chứng âm (nước khử ion)
2, 4, 6: Sản phẩm LAMP với nồng độ dNTP mix là 0,6 mM; 1,0 mM và 1,4 mM Nồng độ dNTP mix ở 1,4 mM có hiệu suất khuếch đại sản phẩm cao hơn các nồng độ dNTP mix thấp. Kết quả này của chúng tôitương đồng nồng độ dNTP trong quy trình được nhóm tác giả Rahman và cộng sự sử dụng, với nồng độ dNTP mix là
1,4 mM và nhóm nghiên cứu thu được các băng điển hình của C.sinensis trên gelagarose [39].
3.1.2.6. Kết quả khảo sát tối ưu thể tích ADN tổng số đưa vào phản ứng LAMP
Mẫu phân chứa rất nhiều vi sinh vật và cũng như các tế bào khác nhau, hơn nữa lượng trứng có trong mẫu phân thường thấp. Việc khảo sát lượng mẫu ADN tổng số đưa vào phản ứng LAMP là cần thiết để phản ứng LAMP không bị ức chế, đồng thời tăng khả năng phát hiện được ADN của sán lá gan nhỏ có trong mẫu phân. Kết quả khảo sát lựa chọn lượng ADN đưa vào phản ứng cho phản ứng LAMP chẩn đoán xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis được trình bầy ở (Hình 3.12).
Hình 3.12. Kết quả khảo sát thể tíchADN khuôn đƣa v o phản ứng LAMP
L: Ladder 100 bp
Giếng 1: Chứng âm (nước khử inon)
Giếng 2: Phản ứng LAMP với thể tích ADN khuôn 2µl Giếng 3: Phản ứng LAMP với thể tích ADN khuôn 3µl Giếng 4: Phản ứng LAMP với thể tích ADN khuôn 4µl Giếng 5: Phản ứng LAMP với thể tích ADN khuôn 5µl
Trong thử nghiệm này, lượng ADN khuôn đưa vào phản ứng tạo sản phẩm khuếch đại ADN không có sự khác biệt lớn. Mặc dù vậy theo một số nghiên cứu đã
khuyến cáo sử dụng lượng ADN 4µl/phản ứng đối với các mẫu tách ADN từ mẫu phân của sán lá gan nhỏ tăng khả năng khuếch đại thành công bởi lượng ADN tách được từ trứng trong phân thường có nồng độ thấp [39].
3.1.2.7. Khảo sát phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP bằng chất chỉ thị màu
Hydroxyl Naphthol Blue (HNB) là một chất chỉ thị màu kim loại.Trong môi trường kiềm (pH 8,6-9,0), có Mg2+ nồng độ 8,0 mM, không có dNTPs, HNB sẽ cho dung dịch có màu tím hồng. Khi bổ sung HNB vào phản ứng LAMP, thời điểm ban đầu dung dịch phản ứng có nồng độ Mg2+
cao, nồng độ dNTPs 1,4 mM, HNB cho dung dịch có màu xanh đậm, khi phản ứng LAMP xảy ra thì nồng độ Mg2+ giảm dần do tham gia vào phản ứng kết tủa với sản phẩm phụ của phản ứng LAMP là pyrophosphate nên dung dịch phản ứng chuyển màu xanh nhạt. Ưu điểm của HNB không gây ức chế phản ứng LAMP nên có thể cho vào hỗn hợp phản ứng trước khi tiến hành phản ứng LAMP, điều này sẽ hạn chế nhiễm chéo sản phẩm LAMP ra môi trường do phải mở nắp ống sau phản ứng gây hiện tượng dương tính giả, thuận tiện cho việc làm giảm bước điện di nên kỹ thuật LAMP có thể thực hiện được ở hiện trường [22]. Do vậy bên cạnh phương pháp phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose, chúng tôi thử nghiệm phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP bằng HNB.
Tiến hành phản ứng LAMP với 4 nồng độ HNB cuối cùng khác nhau là 80µM, 100µM, 120µM và 140µM, HN được thêm vào thành phần của phản ứng LAMP trước khi tiến hành chạy phản ứngtrên máy ủ nhiệt, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả khảo sát nồng độ HN được thể hiện ở hình 3.13 và bảng 3.2.
Hình 3.13.Kết quả khảo sát nồng độ HNB sử dụng cho phản ứng LAMP
Kết quả khảo sát cho thấy cả 4 nồng độ HN được sử dụng đều không ức chế với phản ứng LAMP, màu hiển thị của dung dịch ở mẫu chứng âm xanh đậm
80 µM 100 µM 120 µM 140 µM
hơn ở nồng độ HNB cao so với nồng độ thấp. Quan sát bằng mắt thường có thể phân biệt được rõ ràng mẫu dương tính và mẫu âm tính.
Để tăng tính khách quan trong nhận định kết quả, một thí nghiệm phản ứng LAMP với 4 nồng độ được tiến hành trên cùng 1 mẫu chứng dương, 1 mẫu chứng âm, kết quả phản ứng LAMP được đọc bằng mắt thường bởi 3 người khác nhau, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả đánh giá khả năng phân biệt mẫu dương tính và âm tính khi sử dụng HN được tổng hợp ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả phát hiện sản phẩm LAMP sử dụng HNB bằng mắt thƣờng Nồng
độ HNB
Mẫu xét nghiệm
Đánh giá kết quả LAMP Âm tính (Màu xanh thẫm) Dƣơng tính (M u xanh dƣơng) Số lượng % Số lượng % 80 µM Chứng âm (n=12) 12 100 0 0 Chứng dương (n=12) 0 0 12 100 100 µM Chứng âm (n=12) 12 100 0 0 Chứng dương (n=12) 0 0 12 100 120 µM Chứng âm (n=12) 12 100 0 0 Chứng dương (n=12) 0 0 12 100 140 µM Chứng âm (n=12) 12 100 0 0 Chứng dương (n=12) 0 0 12 100
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy HNB không ức chế phản ứng LAMP, các kết quả xét nghiệm đều cho kết quả chính xác. Sự thay đổi màu giữa mẫu âm tính và dương tính có thể nhận định dễ dàng bằng mắt thường với kết quả đọc của 3 người tham gia cùng một thí nghiệm là tương đồng nhau. Nồng độ HNB 100µM là phù hợp để sử dụng cho phản ứng LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis. Kết quả này tương đồng với một số tác giả khác cũng sử dụng HNB làm chất chỉ thị màu trong đánh giá kết quả phản ứng LAMP[22].
3.1.2.8. Kết quả khảo sát xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng LAMP
Để xác định độ nhạy của phản ứng LAMP sử dụng chứng dương là ADN tái tổ hợp đoạn trình tự gen nad1của C. sinensis được pha loãng với nồng độ khác
nhau. Nghiên cứu này sử dụng 10 nồng độ pha loãng từ 10-3 ng/µl đến 10-12 ng/µl. Tiến hành đánh giá đồng thời bằng 2 thử nghiệm phản ứng LAMP, mỗi thử nghiệm lặp lại 3 lần.
Thử nghiệm 1: Thực hiện phản ứng LAMP không sử dụng chất chỉ thị màu HNB với dãy nồng độ pha loãng ADN trên, phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarosel 2%. Kết quả điện di sản phẩm LAMP thể hiện ở hình 3.14.
Hình 3.14.Kết quả khảo sát ngƣỡng phát hiện LAMP xác định C. sinensis
L: Thang đo 100 bp 1: Chứng âm (nước khử ion)
2-11: Sản phẩm LAMP với nồng độ ADN khuôn lần lượt là 10-3, 10-4, 10-5; 10-6, 10-7; 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12 ng/µl.
Với phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP bằng điện di trên gel agarose 2% Kết quả tại hình 3.14 cho thấy, giếng 1 chứng âm cho kết quả âm tính, từ giếng 2-8 các băng mục tiêu xuất hiện rõ ràng, giếng 9,10,11 không phát hiện được băng mục tiêu. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật LAMP được xác định là 10-9 ng/µl.
Thử nghiệm 2: Thực hiện phản ứng LAMP sử dụng chất chỉ thị màu HNB với dãy nồng độ pha loãng ADN trên, phát hiện sản phẩm bằng mắt thường dựa trên sự chuyển màu của dung dịch phản ứng. Kết quả sản phẩm LAMP thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Kết quả khảo sát ngƣỡng phát hiện của phản ứng LAMP xác định
C. sinensis sử dụng chất chỉ thị m u HNB
1: Chứng âm (nước khử ion)
2-11: Sản phẩm LAMP với nồng độ ADN khuôn lần lượt là 10-3, 10-4, 10-5; 10-6, 10-7; 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12 ng/µl.
Với phương pháp phát hiện trực tiếp sản phẩm LAMP bằng chất chỉ thị màu HNB: giếng 1 chứng âm cho kết quả màu xanh thẫm, từ giếng 2-8 phản ứng tổng hợp ADN xảy ra nên dung dịch chuyển thành màu xanh da trời, giếng 9,10,11 cho kết quả âm tính, thí nghiệm lặp lại 3 lần cho kết quả tương tự. Như vậy độ nhạy của LAMP khi không sử dụng chất chỉ thị màu và có sử dụng HNB 100 µM cho kết quả tương đương nhau. Ngưỡng giới hạn phát hiện của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis ở nồng độ là 10-9
ng/µl ADN tái tổ hợp được chọn là ngưỡng giới hạn phát hiện để tạo chứng dương cho kỹ thuật LAMP.
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã thiết lập được quy trình kỹ thuật LAMP phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người với các thông số và điều kiện thực hiện kỹ thuật chính như sau:
Mồi LAMP thiết kế sử dụng cho quy trình gồm 4 mồi có ký hiệu và trình tự như sau: CS-Nad1-F3: 5’-CTCATGATGGTGGGTGTG-3’ CS-Nad1- 3: 5’-CCAAAGCGCATATTATAACAATG=3’ CS-Nad1-FIP: 5’-CAACCCTTAAAACCCTATAACCAGTTTTGTTCAGTGACGCTTTTGTG-3’ CS-Nad1-BIP: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
5’-GTTGGGGGTCGTATAAAAAGTTTGTTTTAAAACAGGCCTCGAATGT-3 Thành phần và nồng độ hóa chất tham gia phản ứng LAMP gồm:
1X ThermoPol Reaction Bufrer 8 mM MgSO4
1,4 mM dNTP 10 mM
0,2 µM mồi CS-Nad1-F3; 0,2 µM mồi CS-Nad1-B3; 1,6 µM mồi CS-Nad1- FIP; 1,6 µM mồi CS-Nad1-BIP
1 µl Bst DNA polymerase 100 µM HNB
Thể tích ADN khuôn tổng số: 4 µl
Nước khử ion vừa đủ cho phản ứng LAMP trong tổng thể tích 25 µl. Điều kiện và thời gian ủ của phản ứng LAMP
630C trong 60 phút, 800C trong 5 phút.
Giới hạn phát hiện: 10-9ng/µl ADN của C. sinensis
3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis trên ngƣời
3.2.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành
Đề tài đã tiến hành điều tra thu mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành ở người dân tại xã Yên Lộc, huyện im Sơn, tỉnh Ninh ình. Các đối tượng nghiên cứu được lựa chọn là nhóm có nguy cơ nhiễm sán lá gan nhỏ cao với các tiêu chuẩn lựa chọn như sống trong vùng dịch tễ ít nhất 03 năm, từng ăn gỏi cá, có một số biểu hiện lâm sàng như đau bụng, mệt mỏi, chán ăn, rối loạn tiêu hóa, khó tiêu, từ 18