CHƢƠNG III : VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Nội dung nghiên cứu
Thu mẫu tôm sú nuôi và tôm sú tự nhiên từ các khu vực khác nhau của Việt Nam. Kiểm tra, đánh giá, sàng lọc để lựa chọn các mẫu tôm sú không bị nhiễm một số bệnh nguy hiểm: WSSV, IHHNV, YHV, MBV và bệnh Tau ra
- Tách chiết RNA tổng số từ các mô Cơ của tôm sú không mắc các bệnh virus nêu trên : ARN thông tin là phân tử trong các tế bào mang bộ mã từ DNA trong nhân tới các vị trí tổng hợp Protein trong tế bào chất (các riboxom). Vì thông tin trong DNA không thể dịch mã trực tiếp thành protein, đầu tiên nó đƣợc phiên mã, hay sao thành ARN thông tin. Mỗi phân tử ARN thông tin mã hóa cho 1 protein (hoặc hơn 1 protein ở vi khuẩn), với mỗi trình tự 3 ba zơ mang ni tơ trong phân tử ARN thông tin xác định một axit amin đặc thù trong protein. Phân tử ARN thông tin đƣợc vận chuyển qua màng nhân vào tế bào chất, tại đó nó đƣợc dịch mã với sự tham gia của các ARN riboxom và ARN vận chuyển. RNA thông tin từ các cơ quan của tôm nhƣ máu, tuyến gan tụy, cơ sẽ đƣợc tách chiết bằng các kit do nhà sản xuất máy (Liftechnologies) cung cấp.Tinh chế mRNA.
Tạo cDNA từ các mRNA đã được tinh chế : Trong di truyền, DNA bổ sung là DNA đƣợc tổng hợp từ một ARN thông tin khuôn mẫu trong một phản ứng do các enzyme phiên mã ngƣợc và DNA polymerase làm xúc tác. Theo lý thuyết về sinh học phân tử, khi tổng hợp 1 protein, DNA của gen đƣợc phiên mã thành RNA thông tin, RNA thông tin sau đó lại đƣợc dịch mã thành protein. Sự khác nhau giữa gen của sinh vật có nhân chuẩn và không có màng nhân là các gen của sinh vật có nhân chuẩn có thể chứa các intron là các trình tự không mã hóa, ngƣợc với exons là các trình tự mã hóa. Trong quá trình phiên mã, tất cả các RNA intron sẽ bị cắt khỏi bản sao RNA ban đầu và các phần còn lại của RNA sao ban đầu sẽ đƣợc nối đoạn lại thành RNA thông tin.Mặc dù có một số phƣơng pháp để tạo cDNA, thông thƣờng DNA bổ sung thƣờng đƣợc tổng hợp từ RNA hoàn chỉnh (mature) (exon nối hoàn toàn ) sử dụng enzyme phiên mã ngƣợc. Enzyme này thƣờng có mặt tự nhiên ở retrovirus và hoạt động trên một
sợi đơn của RNA thông tin, tạo ra DNA bổ sung của nó dựa trên việc bắt cặp các cặp bazơ.
Kiểm tra, phân tích, đánh giá chất lượng các mẫu cDNA đã tạo được.
Giải mã transcriptome của mô Cơ bằng máy giải trình tự gen thế hệ mới Illumina MiSeq (Tiến hành tại Công ty Cổ phần vật tƣ khoa học Biomedic). Phân tích dữ liệu bằng chƣơng trình phần mềm xác định số lƣợng các contig, tìm các gen liên quan: Dữ liệu short-read thu đƣợc từ giải mã bằng công nghệ RNA- Seq của các mô tôm sú sẽ đƣợc lắp ráp để tạo ra các transcript và tổng hợp lại thành transcriptome
Xây dựng Ngân hàng transcriptome mô Cơ: Các loại dữ liệu transcriptome thu đƣợc cần đƣợc lƣu giữ, quản lý, và khai thác thông qua hệ thống cơ sở dữ liệu (CSDL) tôm sú Việt Nam. CSDL cho phép lƣu giữ dữ liệu transcriptome dƣới dạng các file dữ liệu