Phƣơng pháp tách chiết và tinh chế mRNA tổng số từ mô Cơ

CHƢƠNG III : VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết và tinh chế mRNA tổng số từ mô Cơ

Thu nhận mô cơ của tôm sú:

Lấy 100mg mô cơ để đồng hóa trong trizol. Sau đó li tâm 12.000 vòng/phút ở 4oC và thu dịch nổi, bổ sung vào dịch nổi chloroform:isoamyl (24:1) với tỷ lệ 1:1 sau đó Votex, li tâm 12.000 vòng/phút ở 4oC và thu dịch nổi. Thu kết tủa RNA tổng số bằng việc bổ sung isopropanol với tỷ lệ 1:1 và để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Tiếp tục li tâm 12.000 vòng/phút ở 4o

C, rửa kết tủa thu đƣợc bằng cồn 70% sau đó hòa kết tủa trong elution Buffer.

RNA đƣợc định lƣợng bằng NanoDrop.

Tinh chế 50mg mRNA từ mẫu RNA tổng số. Tinh chế mRNA đƣợc thực hiện với Kit của Invitrogen (Dynabeads mRNA DIRECT TM

Micro Kit), tiến hành nhƣ sau:

Đƣa hạt Dynabeads về nhiệt độ phòng. Lấy 180 µl /mẫu ủ với nƣớc siêu sạch không chứa nuclease tại 80C sau đó đặt trong bể ổn nhiệt với nhiệt độ là 70C.

Bước 2: Tiến hành

a) Rửa hạt beads

Vortex đều hạt beads thành dung dịch đồng nhất. Sau đó dùng pipet hút thể tích hạt beads phù hợp với lƣợng RNA tổng số đầu vào (100 µl) cho vào Ependorf. Đặt Ependorf chứa hạt bead lên giá từ, loại bỏ dịch nổi. Tiếp tục rửa lại hạt beads bằng thể tích tƣơng đƣơng Lysis/Binding Buffer và sau đó hòa tan đều và li tâm nhẹ

b) Xử lý mẫu RNA tổng số

Pha loãng mẫu RNA tổng số sử dụng trong 300 µl siêu sạch không chứa nuclease.

c) Tinh sạch mRNA 2 lần qua cột

Mẫu RNA sau pha loãng đƣợc xử lý nhiệt trong 2 phút ở nhiệt độ là 70C. Sau đó thêm thể tích tƣơng tự Lysis/Binding Buffer vào mỗi mẫu rồi hòa tan đều và li tâm nhẹ. Gắn mRNA vào hạt beads: Chuyển hạt beads vào các giếng của phiến nhựa 96 giếng. Sau đó bổ sung RNA đã xử lý nhiệt vào các giếng. Mix hỗn hợp 10 lần bằng pipet, ủ nhiệt độ phòng trong 5 phút. Tiếp tục đặt phiến lên giá từ, khi dung dịch đã trong trở lại (hạt beads lắng xuống đáy) loại bỏ dịch trong.

Rửa RNA: Chuyển phiến ra khỏi giá từ và bổ sung vào giếng 600 µl Washing buffer A, đảo lên đảo xuống 10 lần bằng pipet, thực hiện tƣơng tự với Washing buffer B

Hòa lại RNA: Cặn hạt từ thu đƣợc sau khi rửa với Washing buffer B đƣợc hòa lại bằng 90 µl nƣớc ấm (80C), mix đều 10 lần và để nhiệt độ phòng 30s.

Gắn lại mRNA vào hạt beads: Bổ sung Lysis/Binding Buffer vào các giếng, mix đều 10 lần, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Tiếp tục đặt đĩa trên giá từ và loại bỏ dịch nổi, lặp lại bƣớc rửa RNA.

Hòa lại mRNA trong 30 µl nƣớc siêu sạch không có không chứa nuclease. Bảo quản mẫu tại 80C.

3.3.2. Tổng hợp cDNA từ mRNA đã tinh chế

3.3.2.1. Sau khi tinh chế, mRNA đƣợc cắt thành các đoạn nhỏ, tiến hành nhƣ sau:

Bổ sung 19 µl RNA Seq Fragmentation Mix vào mỗi giếng của phiến 96 giếng chứa mRNA đã tinh chế. Sau đó gián kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây. Tiếp tục li tâm nhanh phiến trong máy li tâm chuyên dụng để thu dịch trong. Đặt phiến vào máy chu kỳ nhiệt và chạy chƣơng trình để phân cắt RNA: 94o

C 8 phút, sau đó chuyển sang giữ ở 4 o

C.

3.3.2.2. Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất

Chuyển phiến chứa RNA đã phân cắt cùng với hạt từ từ máy chu kỳ nhiệt sang giá từ ở nhiệt độ phòng. Để phiến trên giá từ ít nhất 5 phút. Sau đó nhẹ nhàng chuyển 17 µl dịch nổi chứa RNA đã phân cắt sang phiến nhựa mới. Tiếp tục bổ sung 8,5 µL of First Strand Master Mix/Actinomycin D mixture vào mỗi giếng chứa RNA đã phân cắt, gián kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây. Li tâm phiến ở 1500 x g trong 1 phút. Để phiến vào máy chu kỳ nhiêt và chạy chƣơng trình: bƣớc 1: 25oC 10 phút, bƣớc 2: 37oC 40 phút, bƣớc 3: chyển sang giữ ở 4oC.

3.3.2.3. Tổng hợp cDNA sợi thứ hai:

Bổ sung 25 µl RNA Seq Second Strand và End Repair Enzyme Mix vào 20-µl mẫu cDNA sợi thứ nhất đã chuẩn bị.

Bổ sung 5 µl RNA Seq Second Strand và End Repair Oligo Mix vào mỗi giếng, nhƣ vậy ta sẽ có 50 µl dịch trong mỗi giếng. Sau đó gián kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây. Cho li tâm phiến ở 1500 x g trong 1 phút, để phiến vào máy chu kỳ nhiêt và chạy chƣơng trình: bƣớc 1: 16oC 30 phút, bƣớc 2: chyển sang giữ ở 4o