GIAN CHIẾU SÁNG ĐẾN QUANG CHU KỲ CỦA THỰC VẬT
Cây họ cúc Chrysanthemum đã đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng và đƣợc phân loại là cây ngày ngắn, tức là chỉ ra hoa khi độ dài của ngày ngắn hơn khoảng 13,5 giờ, hay nói cách khác là đêm dài hơn 10,5 giờ (tùy theo loại Cúc). Nhƣ vậy ở Viêt nam, cây Cúc sẽ không ra hoa trong khoảng từ tháng 5 đến tháng 8,
25
và có thể ra hoa trong những tháng còn lại. Vấn đề là ở chỗ, để cây cúc chậm ra hoa, có thời gian dài hơn để sinh trƣởng, nhất là vào mùa đông khi cây cúc rất dễ ra hoa, ngƣời ta dùng chiếu sáng nhân tạo để ức chế sự ra hoa của cây cúc. Các giải pháp điều khiển này đã đƣợc nghiên cứu rất nhiều trên thế giới, chủ yếu dựa trên hai phƣơng pháp: chiếu sáng bổ sung kéo dài ngày và dùng ánh sáng đặc biệt để phá đêm. Để kéo dài ngày cho cây cúc thƣơng mại quan trọng (Dendranthema grandiflora), ngƣời ta dùng đènsợi đốt hoặc đèn huỳnh quang chiếu khoảng 4- 6 giờ một từ ngày, nhƣng cũng có thể dùng phƣơng pháp phá đêm dùng ánh sáng đo trong khoảng vài chục phút để ức chế hoàn toàn sự ra hoa. Việc ứng dụng phƣơng pháp phá đêm phụ thuộc vào đặc tính quang chu kỳ của từng loại cây, độ nhạy phá đêm phụ thuộc vào cấu trúc phổ của ánh sáng, thông lƣợng ánh sáng hấp thụ bởi sắc tố thực vật Phytochrome PC, thời điểm chiếu sáng trong đêm và độ dài chiếu sáng. Học thuyết đƣợc chấp nhận rộng rãi nhất điều chỉnh quá trình ra hoa của thực vật dƣới tác dụng của ánh sáng là học thuyết dựa trên tế bào nhạy quang Phytochrome (PC) do Hendrick và Borthwick đề xuất. Phytochrome là loại sắc tố có hai trạng thái, Pfr và Pr, trạng thái Pfr là trạng thái kích hoạt, còn trạng thái Pr là trạng thái ức chế. Hai trạng thái này của một loại sắc tố gọi là trạng thái đồng phân, tức là có thể luân chuyển tƣơng hỗ sang nhau khi hấp thụ ánh sáng có bƣớc sóng thích hợp. Trạng thái ức chế Pr sẽ chuyển sang trạng thái kích hoạt Pfr khi Phytochrome hấp thụ ánh sáng đỏ R (660 nm), ngƣợc lại, Phytochrome khi ở trạng thái Pfr có thể chuyển lại trạng thái Pr khi hấp thụ ánh sáng FR (730nm), hoặc để lâu trong bóng tối. Phytochrome có mặt trong lá cây từ lúc bắt đầu nảy mầm, trong khi đó diệp lục phát triển dần dần khi đƣợc chiếu sáng. Quá trình sinh trƣởng của cây tiếp tục cho đến khi chuyển sang giai đoạn sinh sản, mà ánh sáng đóng một vai trò quan trọng đối với các loại cây nhạy sáng, trong trƣờng hợp này là cây hoa Cúc. Có bốn thông số chiếu sáng đóng vai trò quan trọng trong tƣơng tác của thực vật với ánh sáng, đó là cấu trúc phổ của ánh sáng, cƣờng độ chiếu sáng, thời gian và thời điểm chiếu sáng. Các thông số này không hoàn toàn độc
26
lập mà phụ thuộc lẫn nhau một cách tƣơng đối, vì vậy để có thể nghiên cứu đƣợc một cách toàn diện tác động của ánh sáng vào quy trình quang hợp và hiện tƣợng quang chu kỳ của một giống thực vật nào đó cần rất nhiều thời gian thí nghiệm.
Các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt nam, một số nghiên cứu về sử dụng ánh sáng điều khiển ra hoa của cây hoa cúc có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau. Năm 2011, tác giả Đặng Thị Tố Nga và các đồng nghiệp (Đại học Thái nguyên) đã sử dụng bóng đèn sợi đốt 100 W chiếu bổ sung 4 giờ 1 đêm, t 22 giờ đêm đến 2 giờ sáng, mật độ 5 m2/bóng, đã tăng chiều cao của cây hoa khoảng 25 cm. Năm 2012, Công ty Bóng đèn Phích nƣớc Rạng Đông đã sử dụng các loại đènkhác nhau nhƣ đèn sợi đốt, đèn compact, đèn phóng điện cao áp (HID) tiến hành chiếu sáng bổ sung với cây hoa Cúc (pha lê vàng Hà nội và đại đóa Đà lạt), trong khoảng thời gian 4 tiếng. Kết quả cho thấy, tỷ lệ ra hoa của công thức không chiếu sáng bổ sung là 73%, trong khi các công thức khác là hoàn toàn không xuất hiện hoa. Vài năm gần đây, những ngƣời trồng hoa ở Đà lạt đã biết sử dụng các loại nguồn sáng khác nhau để chiếu sáng bổ sung cho cây hoa Cúc, nhằm ngăn cản không cho cây ra hoa sớm khi còn chƣa trƣởng thành, đồng thời điều khiển cho cây Cúc ra hoa đúng những thời kỳ quan trọng nhất nhƣ những ngày lễ, ngày Tết.
Trong nghiên cứu ảnh hƣởng của ánh sáng đèn LED bổ sung vào ban đêm lên sự sinh trƣởng và phát triển của hoa Cúc, các tác giả Dƣơng tuấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam (2013) đã sử dụng đènLED có công suất 10 để thay thế bóng đèn compact. Việc sử dụng đènLED không chỉ giảm công suất tiêu thụ điện năng uống 50% mà còn giúp cây sinh trƣởng mạnh hơn so với đèncompact. Tóm tắt lại, quá trình sử dụng kỹ thuật chiếu sáng bổ sung để ức chế sinh sản (ra hoa) ở Việt nam đã trải qua các giai đoạn sau đây:
- Giai đoạn tự phát (trƣớc 2010): sử dụng đènsợi đốt 75-100 W chiếu sáng
4-6 giờ mỗi đêm
27
- Các nhà sản xuất đèn (Cty Rạng Đông, Điện quang 2011): sử dụng đèn
compact 20 W chiếu sáng 4-6 giờ mỗi đêm, tiết kiệm khoảng lần điện năng.
- Chƣơng trình quốc gia về sử dụng năng lƣợng tiết kiệm cùng các đơn vị
Công ty Rạng Đông, Viện Sinh học Tây nguyên (2012): thử nghiệm dùng đènCFL hai phổ và LED tăng trƣởng chiếu sáng 5 giờ mỗi đêm cho cây hoa Cúc, tiết kiệm thêm 0% đến 50% so với đèn CFL thông thƣờng.
28
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Cây hoa cúc giống cúc vàng pha lê trồng tại Trại thực nghiệm Sinh học Cổ Nhuế, đƣợc chiếu sáng phá đêm bằng hệ thống đèn Led do phòng Công nghệ tế bào Thực vật cung cấp.
2.1.2. Thiết bị, hóa chất
Hệ thống nhà lƣới và đèn Led thí nghiệm tại trại Thực nghiệm Sinh học Cổ Nhuế
Thiết bị: Thí nghiệm sử dụng các thiết bị, máy móc của phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Các loại máy móc nhƣ máy nghiền mẫu, máy PCR, máy Real time PCR, bể điện di, máy chụp ảnh gel, máy đo nano drop và một số máy móc dụng cụ, thiết bị khác của các hãng.
Hóa chất: Sử dụng các loại phân bón vi sinh để bón cho cây hoa. Các hóa chất nhƣ Trizol, ethanol, isopropanol, isoamyl, chloroform, Master mix, bộ kit tổng hợp cDNA, thang marker chuẩn… đƣợc cung cấp bởi các hãng hóa chất uy tín và chất lƣợng trên thế giới nhƣ Thermo Fisher, sigma…
Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi sử dụng
Mục đích Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’)
Đối chứng MTP- F GGTGTTATGATTGGTGCTGCTGT
MTP-R ATCTATCTCTCGTGGGGTGCTTT Phân lập gen CO CS-CO- F AAGGTTGAAGTTCGTGGTGG
CS-CO- R TACCTCAACACCCTTGCCTC Đánh giá biểu hiện gen CO CO -F TGGGTGTGTGAAGCTTGTGA CO- R CCTAGGCCTATGACGGACCT Đánh giá biểu hiện gen FT FT- F AGGGAAGTTGCTAACGGGTG
FT-R GCTCCTGTTGTCGCTGGAAT
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
29
2.2.1. Đánh giá ảnh hƣởng của đèn LED đến sự sinh trƣởng phát
triển của cây hoa cúc
Mầm sống của cây hoa cúc đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để trồng thí nghiệm. Tất cả phần mái và khung sắt bao quanh đều đƣợc che bằng lƣới trắng để chống côn trùng gây hại, đồng thời có chức năng tán xạ ánh sáng mặt trời chiếu thẳng. Khu vực xung quanh đƣợc cách ly với khu dân cƣ và hoàn toàn không có ánh sáng nhân tạo vào ban đêm. Nhà thực nghiệm đƣợc chia thành 16 ô thí nghiệm, mỗi ô có kích thƣớc 2m*2,5m. Các ô thí nghiệm đƣợc che ánh sáng xuất phát từ các nguồn sáng treo ở các ô bên cạnh nhờ có các tấm bạt màu trắng cao 2m sử dụng làm tấm cách ly giữa hai phía. Thời gian chiếu sáng và đèn thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ:
Bảng 2.2: Sơ đồ bố trí đèn trong các ô thí nghiệm
TT Ký hiệu ô Tên đèn Thời gian chiếu Chế độ chiếu
Bật Tắt 1 8A Compact 22:00 2:00 4h 2 1A LED 630nm-5W 23:45 0:15 30’( 1’ bật 1’ tắt) 3 1B LED 630nm-5W 22:45 23:15 30’ (1’ bật 1’ tắt 4 2A LED 630nm-5W 0:45 1:15 30’ 5 2B LED 630nm-5W 23:45 0:15 30’ 6 3A LED 630nm-5W 22:45 23:15 30’ 7 3B LED 630nm-5W 23:45 0:15 30’ (1’ bật 1’ tắt) 8 4A LED 630nm-3W 22:45 23:15 30’(1’ bật 1’ tắt) 9 4B LED 630nm-3W 0:45 1:15 30’ 10 5A LED 630nm-3W 23:45 0:15 30’ 11 5B LED 630nm-3W 22:45 23:15 30’ 12 6A LED 660nm-3W 23:45 0:15 30’( 1’ bật 1’ tắt) 13 6B LED 660nm-3W 0:45 1:15 30’ 14 7A LED 660nm-3W 22:45 23:15 30’
15 7B Đối chứng Không chiếu đèn
30
Mục đích của chiếu sáng bổ sung là giảm thời gian tối của mỗi ngày chứ không phải là kéo dài thời gian chiếu sáng liên tục vì vậy nếu chiếu sáng thực hiện vào lúc nửa đêm để chia cắt thời gian tối liên tục thành hai giai đoạn tối, đồng thời cũng là để tăng số giờ chiếu sáng thì hiệu quả hơn nhiều. Nguyên tắc xác định thời gian chiếu sáng bổ sung là làm cho thời gian tối liên tục trong đêm mỗi đoạn ngắn hơn 7 h.
Điều kiện nuôi trồng: các ô thí nghiệm đƣợc trồng trong nhà lƣới chống
côn trùng chế độ chăm sóc và phân bón nhƣ nhau.
Sau khi trồng 10 ngày bắt đầu thời gian chiếu sáng phá đêm.
Thời gian chiếu sáng 25 ngày, sau đó dừng chiếu sáng để cây tiếp tục phát triển và ra hoa.
Chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hại: sau 3 ngày phun thuốc diệt nấm bệnh, cách 15 ngày phun thuốc trừ sâu và nấm 1 lần.
Quan sát và đánh giá sự sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cúc sau khi trồng 40, 70, 100 ngày tuổi.
Song song với việc đánh giá quá trình sinh trƣởng của cây, tiến hành thu mẫu lá non ở các dàn đèn để nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa. Các mẫu đƣợc thu và cất giữ trong tủ -80 đến khi sử dụng.
2.2.2. Phƣơng pháp thu mẫu và tách chiết RNA
Bắt đầu thu mẫu hoa cúc sau khi ngừng chiếu đèn 1 tuần, mỗi tuần thu mẫu một lần đến khi cây hoa cúc bắt đầu xuất hiện nụ thì dừng việc thu mẫu. Thời điểm thu mẫu vào lúc xế chiều khi chuẩn bị bắt đầu chu kì tối.
31
Bảng 2.3: Kí hiệu mẫu thí nghiệm
Kí hiệu Thời gian sau chiếu đèn
L3-1 Đèn Led 3A-1 tuần
L3-2 Đèn Led 3A- 2 tuần
L3-3 Đèn Led 3A- 3 tuần
L3-4 Đèn Led3A- 4 tuần
C-1 Đèn Compact- 1 tuần
C-2 ĐènCompact- 2 tuần
C-3 ĐènCompact- 3 tuần
C-4 ĐènCompact - 4 tuần
ĐB-1 Đèn Led điều biến 1 tuần
ĐB-2 Đèn Led điều biến 2 tuần
ĐB-3 Đèn Led điều biến 3 tuần
ĐB-4 Đèn Led điều biến 4 tuần
K-1 Không chiếu đèn 1 tuần
K-2 Không chiếu đèn 2 tuần
K-3 Không chiếu đèn 3 tuần
K-4 Không chiếu đèn 4 tuần
Mẫu sau khi thu đƣợc bảo quản trong tủ âm 80ºC trƣớc khi sử dụng làm thí nghiệm tiếp theo
Tất cả dụng cụ dùng để tách chiết RNA đều đƣợc khử trùng bằng dung dịch DEPC 0,1% để tránh nhiễm RNase từ dụng cụ.
Quy trình tách chiết RNA đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: Cân 100 mg mẫu, nghiền nhanh bằng nitơ lỏng. Bổ sung 1ml Trizol đảo đều trong 5 phút. Bổ sung tiếp 200 µl chrolofrom: isoamyl (v/v: 24:1) và đảo đều. Li tâm dịch
32
chiết ở 12000 v/p trong 10 phút. Sau đó hút 500 µl dịch pha trên sang ống eppendorf mới và bổ sung 500µl isopropanol lạnh, đảo đều. Ủ dịch ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 phút. Li tâm 12 000 v/p trong 15 phút.Thu cặn, rửa cặn bằng ethanol 70%. Li tâm tiếp 12000 v/p trong 5 phút và bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cuối cùng bổ sung 40 µl nƣớc khử ion đã khử trùng và xử lý DEPC.
Mẫu RNA đƣợc kiểm tra trên gel agarose, định lƣợng và xác định độ sạch bằng máy đo quang phổ NanoDrop.
Sau khi đo nồng độ, mẫu đƣợc pha loãng đến nồng độ 100 ng/μl. Mẫu RNA tổng số sau khi pha loãng đƣợc đo nồng độ lần 2 bằng máy Nanodrop rồi tiếp tục đƣợc pha loãng tới nồng độ 20 ng/μl.
2.2.3. Phƣơng pháp đo nồng độ RNA bằng máy nano drop
Phƣơng pháp này cho phép xác định một cách tƣơng đối nồng độ RNA đồng thời kiểm tra độ tinh sạch của mẫu RNA tách chiết. Sử dụng 1 µl H20 pha dùng để hòa tan RNA làm blank và 1 µl mẫu RNA để đo.
Hàm lƣợng RNA tách chiết đƣợc tính dựa vào hệ số A260=1 tƣơng ứng
với 50 µg/ml. Bên cạnh đó, tỉ số A260/A280 đƣợc sử dụng để đánh giá độ sạch của RNA. Hệ số nằm trong khoảng 1,8-2,0 chứng tỏ chế phẩm RNA có độ sạch cần thiết cho các nghiên cứu phân tích sau đó.
Mẫu RNA tổng số sau đó đƣợc giữ ở -80oC cho đến khi tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo.
2.2.4. Phƣơng pháp RT –PCR (Reverse transcription polymerase
chain reaction)
Tổng hợp cDNA
RNA vừa tách chiết đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp cDNAtheo kít RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
(Thermo Scientific). Phản ứng cDNA đƣợc thực hiện trong thể tích 20 l gồm
có các thành phần sau: 4 g RNA tổng số; 250 ng mồi ngẫu nhiên (Hexamer
primer) . Bổ sung nƣớc khử ion có xử lý DEPC tới thể tích 12 l. Ủ 70°C trong
5 phút, sau đó đặt vào đá. Tiếp tục bổ sung các thành phần vào ống phản ứng
33
trên: 4 l đệm RT 5X tổng hợp cDNA; 1l riboLock Ribonuclease inhibitor
(20u/l); 2 l dNTP (10 mM). Hỗn hợp sau đó đảo và ly tâm nhẹ; ủ 25°C trong
5 phút. Tiếp tục bổ sung 1 l enzyme RevertAid (200 u/l) và thực hiện một chu trình nhiệt nhƣ sau: 25°C/10 phút, 42°C/60 phút, 72°C/10 phút, 40°C/10 phút và 4°C/.
PCR (Poymerase chain reaction)
Sau khi tổng hợp cDNA, phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi MTP và có khuôn cDNA là để kiểm tra chất lƣợng của phản ứng cDNA. cDNA sau khi kiểm tra sẽ đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR khuyếch đại gen CO với cặp mồi đặc hiệu cho gen CO (Bảng 2.2 và 2.3).
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 5.5 2 Master Mix 7,5 3 Primer F 0,5 4 Primer R 0,5 5 cDNA 1 Tổng 15
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 30 giây
25
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
34
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel argarose 1%.
2.2.5. Phân lập gen cảm ứng ra hoa
Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel
Sản phẩm PCR của gen COđƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Sau đó đƣợc tinh sạch theo sự hƣớng dẫn của bộ kit DNA extraction Kit K05013của hãng fermentas. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% nhuộm và cắt lấy băng quan tâm. Cân gel
Bổ sung binding buffer vào ống có chứa đoạn gel vừa cắt theo tỉ lệ 1:1 Ủ ở 65ºC trong 5 phút , đảo nhẹ đến khi gel tan hết
Chuyển hỗn hợp sang cột thôi gel. Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch bên dƣới
Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột thôi gel, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, đổ dịch. Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để loại bỏ hết dung dịch washing buffer.
Chuyển cột lọc sang ống effendorf 1,5ml
Hòa tan DNA trong 30-50 µl nƣớc deion khử trùng. Ủ ở 50ºC trong 5-10 phút
Ly tâm 13000 v/p trong 2 phút. Thu dịch và cất giữ ở tủ -20ºC.
Gắn gen vào vector tách dòng pBT
Sản phẩm tinh sạch gene đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT . Thành