Với điều kiện khí hậu tại Việt Nam đặc biệt là khu vực miền Bắc, vào mùa thu – đông thời gian ngày rút ngắn và ban đêm dài ra nên các loại Cúc dƣới điều kiện bình thƣờng không đƣợc chiếu sáng đều ra hoa sớm với chất lƣợng kém. Nhu cầu sử dụng các nguồn sáng nhân tạo chiếu sáng cho hoa cúc nhằm ức chế cây ra hoa trong các hộ nông dân trồng hoa là rất lớn. Bên cạnh những tiêu chí về hiệu quả sử dụng (hiệu quả ức chế ra hoa) của các loại nguồn sáng, thì nhu cầu tiết kiệm năng lƣợng của các nguồn sáng sử dụng cũng rất đƣợc quan tâm.
Các hình thức chiếu sáng nhằm điều khiển ra hoa của cây cúc đang đƣợc áp dụng rộng rãi nhất hiện nay gồm có: sử dụng đèn sợi đốt 60W, đèn compact 20W. Trong đề tài này chúng tôi đề xuất phƣơng án sử dụng đèn Led tiên tiến để thay thế các loại đèn truyền thống đang sử dụng.
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
50
Giả sử diện tích trồng hoa cúc tại Việt Nam chiếm khoảng 100 ha, trong đó mỗi ha sử dụng khoảng 170 bóng đèn để chiếu sáng. Bài toán tiết kiệm năng lƣợng đƣợc đặt ra với các giả thiết nhƣ sau:
Diện tích trồng Cúc: 100 ha
Số lƣợng đèn sử dụng: 100 × 170 = 17×103 bóng
Đèn sợi đốt 60W chiếu liên tục trong vòng 4 giờ Đèn compact 20W chiếu liên tục trong vòng 4 giờ Đèn LED 5W chiếu liên tục trong vòng 30 phút
Đèn LED 5W điều biến 1 phút bật – 1 phút tắt trong vòng 30 phút Khoảng thời gian cần chiếu sáng trong một vụ: 30 ngày
Các loại đèn thay thế cho nhau theo tỷ lệ 1 đổi 1.
Năng lƣợng điện cần thiết sử dụng trong một ngày để chiếu sáng cho hoa cúc đƣợc tính theo công thức:
E = Số lƣợng đèn × công suất đèn × thời gian thắp sáng (Wh) Năng lƣợng điện cần thiết sử dụng trong cả vụ:
Eo= E × 30 (Wh)
Bảng 3.4: Hiệu quả tiết kiệm năng lƣợng
Tên đèn Năng lƣợng (kW.h) % tiết kiệm so với đèn sợi đốt
Sợi đốt 60W 122400 0
Compact 20W 40800 67
LED 5W 1275 99
LED 5W - 1phút 637 99.5
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
51
Hình 3.8:Tổng năng lƣợng sử dụng trong một vụ
Khi sử dụng đèn compact để chiếu sáng sẽ tiêu tốn năng lƣợng hơn gấp hơn 20% so với đèn Led trong khi hiệu quả kĩm hãm ra hoa và các chỉ tiêu sinh lý không cao hơn khi sử dụng đèn Led. So với đèn sợi đốt, đèn Led tiết kiệm tới 99% điện năng tiêu thụ, một con số không nhỏ trong bài toán tiết kiệm năng lƣợng. Sử dụng đèn Led để chiếu sáng phá đêm hoa cúc vừa có tác dụng kìm hãm thời gian ra hoa của cây, tăng chất lƣợng của bông so với khi không chiếu đèn vừa tiết kiệm đƣợc năng lƣợng hơn so với đèn compact và đèn sợi đốt. Nhƣ vậy, đèn Led có thể xem là một thay thế có hiệu quả so với các phƣơng thức chiếu đèn truyền thống.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CO ĐIỀU KHIỂN QUÁ TRÌNH RA HOA Ở CÂY HOA CÚC
3.2.1. Tách chiết RNA tổng số
Sử dụng phƣơng pháp tách chiết RNA bằng Trizol. Các phân tử RNA đều không bền, dễ bị phân hủy bởi RNase. Hơn nữa, RNase lại có mặt ở khắp mọi nơi, có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân thƣờng dùng để
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
52
loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt ở 90ºC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính của RNase. Chính vì vậy, việc tách chiết RNA đòi hỏi thao tác làm phải thân trọng, luôn sử dụng găng tay trong quá trình tách chiết và dụng cụ thí nghiệm đều phải đƣợc xử lí với DEPC 0,1%, các hóa chất khác đƣợc pha trong nƣớc DEPC 0,01% trƣớc khi sử dụng.
RNA vừa tách chiết đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy đã tách chiết thành công RNA tổng số của cây hoa cúc.
Hình 3.9: Kết quả điện di tách chiết RNA tổng số trên gel agarose 1%
M: Marker, 1: L3-1, 2: Compact-1, 3: Đèn sợi đốt-1, 4: Đối chứng không chiếu đèn-1
Đo hàm lƣợng các mẫu RNA tổng số
Để xác định hàm lƣợng và chất lƣợng của RNA tổng số tách chiết nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo, sản phẩm RNA tổng số nồng độ và độ tinh sạch thông qua hệ thống Thermo Scientific NanoDrop 2000.
Các phân tử nucleic acid (DNA và RNA) hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm, thông thƣờng các sản phẩm tách chiết RNA hay DNA sẽ có lẫn một lƣợng protein nhất định, nên khi đánh giá mức độ sạch và
hàm lƣợng RNA trong mẫu tách chiết chúng ta dựa vào chỉ số A260/ A280. Một
sản phẩm RNA hay DNA đƣợc coi là tinh kiết nếu chỉ số A260/ A280 nằm trong
khoảng 1,8-2,0.
M 1 2 3 4
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
53
Bảng 3.5: Kết quả định lƣợng RNA tổng số bằng Nano Drop
Mẫu A260/A280 Nồng độ ng/μl L3-1 1,92 270,3 L3-2 2,2 321,8 L3-3 1,85 232,7 L3-4 1,98 186,5 C-1 2,05 214,5 C-2 1,93 137,7 C-3 1,87 203,9 C-4 2,11 217,4 K-1 1,86 199,2 K-2 2,1 189,6 K-3 1,89 259,2 K-4 1,95 193,8 ĐB-1 1,9 225,5 ĐB-2 1,95 198,6 ĐB-3 1,88 223,5 ĐB-4 2,07 215,7
*Ghi chú: L3-1 - L3-4: các mẫu cúc luống 3A thu sau khi dừng chiếu đèn 1-4 tuần C1-C4: các mẫu cúc luống chiếu đèn compact thu mẫu sau dừng chiếu đèn 1-4 tuần K1- K4: các mẫu cúc luống không chiếu đèn thu mẫu sau dừng chiếu đèn 1-4 tuần ĐB1-ĐB4: mẫu cúc luống chiếu đèn điều biến 4A thu mẫu sau dừng chiếu đèn 1-4 tuần
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
54
Kết quả định lƣợng RNA tổng số thể hiện trên cho thấy RNA vừa tách chiết có đủ nồng độ và đảm bảo độ sạch để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Kết quả phân lập gen CO
3.2.2.1. Đánh giá chất lƣợng mRNA
Bƣớc phiên mã ngƣợc (reverse transcript) là rất quan trọng quyết định độ nhạy và tính chính xác khi định lƣợng, vì số lƣợng cDNA đƣợc tạo ra, phải phản ánh một cách chính xác số lƣợng đầu vào của mRNA. Chất lƣợng của RNA vừa tách chiết là nhân tố quan trọng quyết định chất lƣợng và thành công của phản ứng tổng hợp cDNA. RNA rất dễ bị phân hủy bởi RNase vốn có ở khắp mọi nơi trong môi trƣờng phòng thí nghiệm. Vì vậy, việc bảo quản RNA luôn đòi hỏi thực hiện nghiêm ngặt ở -80ºC khi chƣa sử dụng.
Trong thí nghiệm này, RNA ngay sau tách chiết và sau khi bảo quản ở -
800C đƣợc sử dụng để tổng hợp cDNA. cDNA tổng số đƣợc tổng hợp bằng bộ
kit First Strand cDNA Synthesis Kit của hãng Thermo Scientific sử dụng mồi random hexamers. Để đánh giá chất lƣợng của sản phẩm cDNA, 1 µl của cDNA đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại gen
MTP. Theo tính toán lý thuyết , cặp mồi này sẽ nhân đƣợc đoạn gen có kích
thƣớc 184 bp
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
55
Hình 3.10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi MTP
M: Thang DNA chuẩn 1kb, mẫu 1-4: L1- L4; 5-8: C1- C4; 9-12: K1-K4; 13-16: ĐB 1- ĐB4
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR cho thấy tại các đƣờng chạy đều xuất hiện một băng DNA sáng sắc nét chứng tỏ gen MTP đã đƣợc khuếch đại thành công từ cDNA các mẫu lá hoa cúc. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tổng hợp đƣợc nguồn cDNA đủ hàm lƣợng và chất lƣợng từ lá qua các giai đoạn phát triển khác nhau làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.11: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi đặc hiệu (CS_CO F/R) sử dụng khuôn là cDNA tổng hợp từ RNA tổng số của các mẫu hoa cúc.
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1000 250 184 1000 250 1200 Bp M 1 2 3 4 5 6 download by : skknchat@gmail.com
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
56
M: Thang DNA chuẩn 1kb, 1-5: các mẫu cDNA hoa cúc dƣới các điều kiện chiếu sáng khác nhau.
cDNA vừa tổng hợp tiếp tục đƣợc sử dụng để khuyếch đại gen đích CO bằng cặp mồi đặc hiệu CS_CO F/R. Theo tính toán lí thuyết kích thƣớc của sản phẩm PCR là 1200 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy có một phân đoạn DNAsắc nét, có kích thƣớc khoảng 1200 bp đúng nhƣ tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ gen CO đã đƣợc khuyếch đại thành công. Tuy nhiên để khẳng định chính xác đây là gen CO thì đoạn gen này tiếp tục đƣợc tách dòng và xác định trình tự.
3.2.2.2. Kết quả tách dòng gen
Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT do phòng Công nghệ Tế bào thực vật cung cấp . Để việc gắn có hiệu quả, sản phẩm PCR từ gen đích đƣợc làm sạch, thu duy nhất một băng đặc hiệu có kích thƣớc mong muốn và loại bỏ những thành phần tạp chất nhƣ mồi, đệm, enzyme...Quá trình làm sạch DNA thực hiện theo sự hƣớng dẫn của bộ kit hãng Fermentas.
Sản phẩm thôi gel sau đó đƣợc gắn vào vector pBT dƣới sự xúc tác của enzyme T4 ligase. Kết quả chúng tôi thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc, chọn ở mỗi mẫu 4 khuẩn lạc để tiến hành colony PCR với cặp mồi pUC18F/R. Theo tính toán sản phẩm PCR sẽ cho kích thƣớc khoảng 1364 (=1200+164) bp.
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
57
Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm colony PCR với cặp mồi pUC18F/R
M: Thang DNA chuẩn 1kb, 1-5 dòng khuẩn lạc đại diện cho từng mẫu cúc ở các công thức chiếu sáng khác nhau
Sản phẩm colony PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.12) cho những băng có kích thƣớc đúng nhƣ dự đoán. Những dòng khuẩn lạc này tiếp tục đƣợc nuôi lỏng, tách chiết plasmid và đọc trình tự.Kết quả xác định và phân tích trình tự cho thấy kích thƣớc đoạn gen phân lập là 1200 bp đúng nhƣ tính toán lý thuyết. Trình tự này tiếp tục đƣợc so sánh bằng BLAST trong NCBI, kết quả cho thấy trình tự thu đƣợc chính là trình tự gen CO của loài hoa cúc chi Chrysanthemum.
3.2.2.3. Kết quả phân tích trình tự gen CO
Trình tự gen CO của thể phân lập COL-clone36 đƣợc so sánh với bốn thể phân lập thuộc chi Chrysanthemum đã đƣợc công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen (Bảng 3.). Phân tích trình tự cho thấy trình tự gen CO của thể phân lập COL-clone36 có độ tƣơng đồng khá cao so với bốn thể phân lập còn lại, độ tƣơng đồng dao động từ 98,5 (so với thể phân lập AB733628_Nhật bản) đến 99,7% (so với thể phân lập KC175548và JQ693394 _Trung Quốc) ở mức độ nucleotide và 98,6 (so với thể phân lập AB733628_Nhật bản) đến 99,7%
250
1 2 3 4 5 M bp
1364
1000
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
58
(so với thể phân lậpJQ693394_Trung Quốc) ở mức độ amino acid. Có 36 vị trí nucleotide sai khác giữa các thể phân lập nhƣng chỉ có 8 vị trí làm thay đổi trình tự amino acid .
Bảng 3.6: Mã số trong Ngân hàng dữ liệu gen và vùng phân lập của các thể phân lập thuộc chi cúc Chrysanthemum sử dụng trong phân tích, so sánh trình tự gen CO
STT Mã số trong NCBI Vùng phân lập
1 KC175548 Trung Quốc
2 JQ693394 Trung Quốc
3 KC589293 Trung Quốc
4 AB733628 Nhật Bản
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục
59
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 ATGTTGGATCATAGTAGTGCTTTATGCCTCAAAACAAGTACTAGCTTTGCTCGAGTTTGCGACACTTGTCGTTCCGCACCTTGTACCATATACTGTCGCCCAGACGCGGCCTACTTATGC KC175548_China .............................................................................................................. JQ693394_China .................................G............................................................................ KC589293_China ..................C........A.............C..............................G..C.........................C..G......... AB733628_Japan .........................................C.................................................................... 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 ACCGCGTGTGATGCCCGCATACACGCGGCGAATAAGCTCCAGTCTTCTCAACACGAGCGCGTCTGGGTGTGTGAAGCTTGTGAGCAAGCTCCAGCTGCTTTTATATGCAAGGCGGATGCT KC175548_China .................................................................................................... JQ693394_China .................................................................................................... KC589293_China ...............C.................................G.................................................. AB733628_Japan .................................................G.................................................. 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 GCCTCACTTTGCGTCACTTGTGACGCGGATATCCATGCTGCAAACCCTCTTGCCAGAAGGCATCACCGCGTCCCGGTGATGCCTATTCCTGGCGCAATGTATGGACCTCGGGCTAATGAC KC175548_China .............................................................................................................. JQ693394_China .............................................................................................................. KC589293_China ..........................A.............................................C......................................... AB733628_Japan ...................................................T.......................................................... 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 CCGAGGTCCGTCATAGGCCTAGGAGTTGATTCTCACAGTGGATTTTTATCAGGAACGGAACAAGGTGATGACACTATTGATGATGAGGACGAAAGTGAAGCAGCTTCATGGTTACTATTC KC175548_China ...................................................................................................................
JQ693394_China ...................................................................................................................
KC589293_China ...........A..T...........................................................................C........................
AB733628_Japan ........T..A..T..........G.........A...............A........C..............C..............C..................T.....
490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 GATGGTCCTGCACAGAAAAACAGTCAAAATGGAAATACCAAATTAGAAAGCGGTTTTTTATTCAATGGAGAAGGTGGTGAGGATGAGTATTTGGAGTTTATGGAATTTGGAGGTGATGAT KC175548_China ................................................................................................... JQ693394_China ................................................................................................... KC589293_China .............C..................................................................................... AB733628_Japan ..C..........C..................................................................................... 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 CAACAACAATGTTTCAATAAAGGGTCCGAAAAAATGTATAGTAGTGCTAATGGCGAGGCCGATAGCGTGGTGCCGGTTCAGAAGAATCATCATCAGATTCATCACCATGAAGTCCGCAAC KC175548_China ........................................................................................................A.... JQ693394_China ........................................................................................................A.... KC589293_China ........................................................................................................A.... AB733628_Japan .................................................................T........................................A.... 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 CAAAAGTTTCAGCTTGGGATGGAATATGAGTCATCTAATGGTGGTGCTAGTGGTGGTTATGGCTATCCTGTACTTACTCATAGTGTTTCCATGTCATCGATGGAAGTAGGAGTCGTACCA KC175548_China .................................................................A.......................................T............ JQ693394_China ........C.............................................C............................................................... KC589293_China ......................................................C...........................................................G... AB733628_Japan ......................................................C...........................................................G... 850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950 960 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 GATTCAACAAGAACCGAACATTCGTTGTCAACTCCTAGACCCGCAAAAGGGACAATCGATCTATTCTCAAACCCTCAAGTTCAAGTGGCGACCCAACTCTCTCCAATGGATCGAGAGGCA KC175548_China ...................................................................................................................... JQ693394_China ...................................................................................................................... KC589293_China ...................................................................................................................... AB733628_Japan ..........................................T....................................................G........................ 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
COL_clone36 AGGGTGTTGAGGTACAGAGAGAAGAAGAAAACAAGAAAATTTGAAAAAACAATACGCTATGCATCAAGAAAAGCTTACGCGGAAACAAGGCCAAGGATCAAAGGTCGTTTCGCTAAAAGA KC175548_China .................G........................................................................................... JQ693394_China ............................................................................................................. KC589293_China ............................................................................................................. AB733628_Japan ............................................................................................................. 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . .
COL_clone36 ACAAATGGAGATGTTGATGTGGACCAAATGTTTCCTACAAACCATATGGTAGAAGGCGGATATGGTATTGTCCCTTCATTTTAG KC175548_China ...............................................................................
JQ693394_China ...............................................................................
KC589293_China ...............................................................................
AB733628_Japan ..T.....................................................T........................
Hình 3.13 : Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen CO của thể phân lập COL-clone36 với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu gen.
BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục