3. Nội dung nghiên cứu
2.2.9. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để thống kê số liệu và phần mềm DNAStar trong phân tích hệ gen.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của mẫu đậu Nho Nhe
Hai mẫu đậu Nho nhe thu tại Yên Bái (NN01-YB) và Lai Châu (NN10-LC) được trồng tại vườn thí nghiệm sinh học của khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên để nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu. Kết quả nghiên cứu hình thái và giải phẫu như sau:
A B
C D
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái thân, lá (A), hoa (B), quả (C) và hạt (D) của mẫu đậu Nho nhe
Đo, đếm xác định kích thước về chiều dài lá, số lượng lá chét và kích thước lá chét được thực hiện theo phương pháp thông thường. Kết quả nhận thấy, hai mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC có kích thước và chiều dài lá khá giống nhau. Lá có
3 chét, hình quả tim, có lông tơ nhám. Lá chét trung tâm có gân lá đối xứng và có cuống dài hơn so với lá chét hai bên. Lá chét 2 bên mọc đối diện và gân lá không đối xứng. Lá của 02 mẫu đậu Nho nhe đều có màu xanh đậm (Hình 3.1).
Đo, đếm số lượng và kích thước nụ hoa, kích thước các bộ phận của hoa bằng thước kẹp panme. Quan sát mô tả hình thái, đo kích thước quả, hạt bằng thước kẹp panme; xác định khối lượng 100-1000 hạt bằng cân điện tử có độ chính xác 10-4 gram cho từng mẫu riêng biệt, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Kết quả nhận thấy: Đặc điểm hình thái hạt là một trong những chỉ tiêu quan trọng có ý nghĩa trong công tác chọn tạo giống. Đôi khi có thể dựa vào chỉ tiêu này để đánh giá giống, nhất là năng suất và khả năng chống chịu. Hạt của mẫu đậu Nho nhe NN01-YB dài, hình dạng vỏ hạt thuộc loại rạn vỏ, màu nâu đỏ, rốn hạt màu trắng; khối lượng của 1000 hạt đạt 50,74 g. Đặc điểm về hình dạng và màu sắc hạt của mẫu đậu Nho nhe NN10-LC cũng tương tự như mẫu đậu Nho nhe NN01-YB. Khối lượng của 1000 hạt đậu Nho nhe NN10-LC đạt 49,68 g và nhẹ hơn so với đậu Nho nhe NN01-YB (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái hạt của 02 mẫu đậu Nho nhe
TT Mẫu Hình dạng hạt Hình dạng vỏ hạt Màu vỏ hạt Màu rốn hạt Khối lượng 1000 hạt (g) 1 NN01_YB Dài Rạn vỏ Nâu đỏ Trắng 50,74 2 NN10-LC Dài Rạn vỏ Nâu đỏ Trắng 49,68
Về màu sắc thân (thân non) của 02 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC đều có màu tím và màu xanh; thân bò, leo, trên thân có nhiều lông tơ nhám. Màu sắc lông trên thân là lông trắng. Màu sắc hoa của 02 mẫu đều có màu vàng, hoa tự nở ở nách lá, mang nhiều hoa. Quả cong, hình kiếm, dài từ 6-8 cm (Hình 3.1).
Nghiên cứu giải phẫu lá, thân và rễ của 02 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC chúng tôi nhận thấy, giải phẫu của phiến lá, thân và rễ của cả 02 mẫu đều có cấu tạo các phần giống nhau.
Phiến lá: Gồm biểu bì trên (1), mô đồng hóa (gồm 3 lớp tế bào mô giậu (2) ở phía trên và 2 lớp mô xốp (3) ở phía dưới), biểu bì dưới (4). Gân chính phân biệt mặt
trên và mặt dưới rất rõ. Giữa gân chính có các vòng mô cứng (5), các bó dẫn nằm trong khối mô mềm. Có các bó gỗ (6) nằm phía trong và bó libe (7) nằm phía ngoài. Các bó dẫn nằm cách xa nhau và phía ngoài là mô mềm (8) và mô dày (9) (Hình 3.2).
Hình 3.2. Giải phẫu lá của đậu Nho nhe
1. Biểu bì trên; 2. Mô giậu; 3. Mô xốp; 4. Biểu bì dưới; 5. Vòng mô cứng; 6. Gỗ; 7. Libe; 8. Mô mềm; 9. Mô dày
Thân cây: Gồm biểu bì (1): Phủ ngoài thân là một lớp tế bào biểu bì dày gồm những tế bào hình trứng xếp sít nhau uốn lượn theo thân tạo thành vòng ngoài cùng có 6 đỉnh lồi ra ngoài. Mô dày (2) gồm 3-5 lớp tế hình đa giác tập trung chủ yếu ở phía các mấu lồi. Các lớp tế bào mô mềm vỏ (3) có kích thước lớn hơn ăn sâu xen kẽ với các tế bào nội bì. Đám mô cứng (4) gồm những đám tế bào hình đa giác bắt màu xanh tạo thành vòng tròn không liên tục. Trụ giữa chiếm thể tích lớn trên lát cắt ngang gồm khoảng 20 bó dẫn hở. Các bó gỗ (7) cạnh nhau được ngăn cách bởi các tia ruột rộng tạo ra khoảng trống khá xa nhau. Phía ngoài đối diện với các bó gỗ là các bó libe (5) tương ứng bắt màu hồng. Xen giữa gỗ và libe là tầng phát sinh (6) gồm các tế bào dẹt có màng rất mỏng. Mô mềm ruột (8) nằm ở phần giữa thân gồm các tế bào hình đa giác có kích thước khác nhau. Đây là các tế bào sống thực hiện chức năng chủ yếu là dự trữ (Hình 3.3).
Hình 3.3. Giải phẫu thân của đậu Nho nhe
1. Bần; 2. Mô dày; 3. Mô mềm vỏ; 4. Đám mô cứng; 5. Libe; 6. Tầng phát sinh; 7. Gỗ; 8. Mô mềm ruột
Rễ cây: Phía ngoài cùng của rễ cấu tạo bởi một lớp tế bào biểu bì có thành tế bào hóa bần (1) hình chữ nhật độ dày khoảng 0,3µm. Phía trong là vỏ thứ cấp gồm nhiều lớp tế bào libe (4), mô cứng (3) và mô mềm vỏ (2). Trụ giữa chiếm phần lớn diện tích gồm các mạch gỗ (5) to bắt màu xanh và tia gỗ đó là gỗ thứ cấp và mô mềm ruột (6) (Hình 3.4).
Hình 3.4. Giải phẫu rễ của đậu Nho nhe
3.2. Đặc điểm hóa sinh của mẫu đậu Nho nhe 3.2.1. Hàm lượng protein tan tổng số 3.2.1. Hàm lượng protein tan tổng số
Nghiên cứu hàm lượng protein tan tổng số nhằm xác định giá trị dinh dưỡng của đậu Nho nhe và kiểm tra được sự khác biệt về đặc điểm hóa sinh liên quan tới điều kiện thổ nhưỡng. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein tan tổng số của mẫu đậu Nho nhe NN01-YB thu tại tỉnh Yên Bái đạt 30,3 mg/100g hạt; trong khi mẫu đậu Nho nhe NN10-LC thu tại tỉnh Lai Châu đạt 29,1 mg/100g hạt. Như vậy, hàm lượng protein tan trong hạt đậu Nho nhe NN10-LC thấp hơn so với NN01-YB.
Nghiên cứu của Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Nguyễn Văn Tuân (2007) đã chỉ ra hàm lượng protein tan tổng số của 11 giống đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng dao động từ 20,99-26,75%. Như vậy, hàm lượng protein của đậu Nho nhe trong nghiên cứu này khác so với kết quả đã công bố.
3.2.2. Hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe
α-amylase là enzyme tham gia thuỷ phân tinh bột tạo thành đường. Đường tạo thành có vai trò làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào, từ đó làm tăng tính chống chịu của thực vật với các yếu tố cực đoan từ môi trường, giúp cây non phát triển bình thường. Hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe NN01-YB ở giai đoạn 2-3 ngày tuổi lần lượt đạt 1,0; 1,2 U/mg. Hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe NN10-LC ở giai đoạn 2-3 ngày tuổi lần lượt đạt 1,0; 1,14 U/mg. Như vậy, mầm hạt đậu Nho nhe trong nghiên cứu có khả năng sinh ra α-amylase.
So sánh hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe trong nghiên cứu này với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Nguyễn Văn Tuân (2007) trên đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng sau 5 ngày. Kết quả nhận thấy, hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe trong nghiên cứu này cao hơn so với đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng hoạt tính enzyme dao động từ 0,573-0,941 U/mg protein.
3.2.3. Hoạt tính protease từ mầm đậu Nho nhe
Protease là một enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình nảy mầm của hạt, sự phát triển của cây non và có liên quan đến khả năng chịu mất nước của tế bào. Nghiên cứu hoạt tính protease từ mầm đậu Nho nhe nhằm đánh giá mối liên quan với
hàm lượng protein có trong hạt. Kết quả khảo sát nhận thấy, hoạt tính protease ở thời gian hạt nảy mầm 2-3 ngày tuổi lần lượt đạt 2,0 và 2,2 U/mg ứng với đậu Nho nhe trồng tại Yên Bái NN01-YB. Hoạt tính protease đối với hạt nảy mầm 2-3 ngày tuổi lần lượt đạt 1,4 và 2,0 U/mg đối với đậu Nho nhe trồng tại Lai Châu NN10-LC. Kết quả nghiên cứu này cũng thể hiện mối tương quan với hàm lượng protein tổng số có trong hạt và liên quan tới tốc độ nảy mầm của hạt.
3.2.4. Hàm lượng isoflavone từ mầm hạt đậu Nho nhe
Isoflavone là các polyphenolkhông màu thuộc lớp flavonoid. Isoflavone trong đậu tương gồm daidzein, genistein và glycitein được tổng hợp thông qua con đường phenypropanoid với sự tham gia của nhiều enzyme, trong đó có hai loại enzyme quan trọng tham gia tổng hợp isoflavone được biết đến là chalcone isomerase và isoflavone synthase. Các chất này chỉ khác nhau về nguyên tử hydro và các nhóm hydroxyl. Genistein chỉ khác daidzein ở nhóm hydroxyl liên kết với carbon số 5. Daidzein và genistein là những chất isoflavone phổ biến nhất, có cấu trúc hóa học đặc trưng.
Bảng 3.2. Hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi
của 2 mẫu đậu Nho nhe
Isoflavone NN01-YB (µg/100g hạt) NN10-LC (mg/100g hạt) Daidzein 3,190,22 4,210,05 Genistein 0 0
Isoflavone (daidzein + genistein) 3,19 41,28
Sử dụng kỹ thuật phân tích HPLC định lượng daidzein và genistein chiết từ hạt đậu Nho nhe nảy mầm 3 ngày tuổi từ sắc ký đồ ở hình 3.5 và phương trình đường chuẩn kết quả phân tích HPLC được thể hiện ở bảng 2.3. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, ở mẫu đậu Nho nhe NN10-LC, trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi có hàm lượng daidzein đạt 4,21 mg/100g và hàm lượng genistein không có. Trong khi, mẫu đậu Nho nhe NN01-YB hàm lượng daidzein khá nhỏ, hàm lượng đạt 3,19 µg/100g hạt và hàm lượng genistein không có. Hàm lượng daidzein và genistein của 2 mẫu đậu Nho nhe có sự khác biệt ở mức ý nghĩa
phân tích cho thấy isoflavone trong mầm hạt đậu Nho nhe của Lai Châu và Hà Giang chỉ có một nhóm chất là daidzein. AU 0.00 0.05 0.10 0.15 Minutes 5.00 10.00 15.00 20.00 A 1 6 .9 3 8 - 8 9 5 9 0 1 AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 B
Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ mầm hạt đậu Nho nhe sau 3 ngày tuổi
A: Nho nhe NN01-YB; B: Nho nhe NN10-LC
Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa sinh của 2 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC cho thấy hàm lượng protein, hoạt tính α-amylase, protease và hàm lượng isoflavone giữa 2 mẫu có sự khác nhau được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Đặc điểm hóa sinh của 02 mẫu đậu Nho nhe
3.3. Đặc điểm của vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho Nhe
Mẫu đậu Nho nhe thu tại tỉnh Yên Bái và tỉnh Lai Châu được nhận diện dựa trên vùng gen ITS. Tiến hành tách DNA tổng số từ mầm cây đậu Nho nhe được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose và đo quang phổ, kết quả DNA thu được đảm bảo chất lượng cho phản ứng nhân gen.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số 1: Vùng gen ITS từ đậu Nho nhe NN01-YB, 2: Vùng gen ITS từ đậu
Vùng gen ITS từ cây đậu Nho nhe được phân lập bằng phản ứng PCR từ DNA hệ gen sử dụng cặp mồi đặc hiệu trong bảng 2.3. Sau khi điện di kiểm tra, sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 460 bp (Hình 3.6) ứng với vùng gen ITS từ cây đậu Nho nhe thu tại tỉnh Yên Bái và Lai Châu.
A
B
Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC được xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer có kích thước là 458 nucleotide (Hình 3.7).
A
B
Hình 3.8. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS của mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với một số trình tự vùng
Bằng phần mềm BLAST trong NCBI cho thấy, vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho nhe NN10-LC và NN01-YB ở Việt Nam có tỷ lệ tương đồng lần lượt là 100% và 99% so với trình tự vùng gen ITS của loài Vigna umbellata trên GenBank có mã số KX087818 (Hình 3.8).
A
B
Hình 3.9. Trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với trình tự vùng gen ITS mang mã số KX087818 trên GenBank
Như vậy, kết quả so sánh bằng BLAST trong NCBI đã khẳng định được trình tự đoạn DNA phân lập từ hai mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC là trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ loài đậu Nho nhe Vigna umbellata ở Việt Nam.
Kết quả so sánh trình tự nucleotit của vùng gen ITS của hai mẫu đậu Nho nhe với trình tự vùng gen ITS mang mã số KX087818 được trình bày ở Hình 3.9. So sánh trình tự vùng gen ITS của 2 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC, nhận thấy trình tự vùng gen ITS của 2 mẫu này có độ tương đồng 99,6%; có sự khác nhau về trình tự nucleotide tại 02 vị trí số 30 (T thay bằng A) và số 37 (G thay bằng C).
Tiến hành phân tích mối quan hệ giữa các loài đậu thuộc chi Vigna dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS công bố trên GenBank bằng phần mềm MegAlign, kết quả xác định được hệ số tương đồng, hệ số phân ly và sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các cây đậu Nho nhe ở Việt Nam với các loài thuộc chi Vigna trên thế giới. Các trình tự vùng gen ITS sử dụng phân tích được thống kê gồm 5 loài
V. umbellata (KX087818.1), V. angularis (JF421525.1), V. Glabrescens
(KX087721.1), V. hirtella (KX087729.1) và V. reflexopilosa (KX087791.1). Kết quả cho thấy hệ số tương đồng từng cặp so sánh dao động từ 96,6-99,6%; hệ số phân ly dao động từ 0,2-3,3%. Hai trình tự vùng gen ITS của mẫu NN01-YB và NN10-LC có hệ số tương đồng là 99,6%; và tương đồng 98,6-99,1% với loài đậu Nho nhe V. umbellata (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên GenBank
Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây đậu Nho nhe dựa trên trình tự vùng gen
ITS và 5 loài trên GenBankđược thể hiện ở hình 3.10. Như vậy, 2 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC trong nghiên cứu có tên khoa học là Vigna umbellata.
Hình 3.10. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên GenBank
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xác định được đặc điểm hình thái rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt và đặc điểm giải phẫu rễ, thân, lá của 2 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB thu tại tỉnh Yên Bái và NN10-LC thu tại tỉnh Lai Châu là giống nhau.
Hàm lượng protein tan tổng số của mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC lần lượt đạt 30,3 mg/100g hạt và 29,1 mg/100g hạt. Hoạt tính α-amylase có trong mầm hạt đậu Nho nhe của mẫu NN01-YB và NN10-LC lần lượt đạt 1,0-1,2 và 1,0- 1,14 U/mg. Hoạt tính protease trong mầm hạt đậu Nho nhe của mẫu NN01-YB và NN10-LC lần lượt đạt 2,0-2,4 và 1,4-2,0 U/mg. Isoflavone trong mầm mẫu đậu hạt đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC 3 ngày tuổi chỉ chứa daidzein (NN01-YB đạt 3,19 µg/100g hạt, NN10-LC đạt 4,21 mg/100g) và không có genistein.
Vùng gen ITS đã được phân lập và giải trình tự có độ dài 458 nucleotit và khẳng định mẫu đậu nho nhe thu tại Yên Bái và Lai Châu thuộc loài Vigna umbellata.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc điểm sinh học của giống đậu Nho nhe Yên Bái và Lào Cai để cung cấp đầy đủ các thông tin về giống.