3. Nội dung nghiên cứu
3.2. Đặc điểm hóa sinh của mẫu đậu Nho nhe
3.2.1. Hàm lượng protein tan tổng số
Nghiên cứu hàm lượng protein tan tổng số nhằm xác định giá trị dinh dưỡng của đậu Nho nhe và kiểm tra được sự khác biệt về đặc điểm hóa sinh liên quan tới điều kiện thổ nhưỡng. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein tan tổng số của mẫu đậu Nho nhe NN01-YB thu tại tỉnh Yên Bái đạt 30,3 mg/100g hạt; trong khi mẫu đậu Nho nhe NN10-LC thu tại tỉnh Lai Châu đạt 29,1 mg/100g hạt. Như vậy, hàm lượng protein tan trong hạt đậu Nho nhe NN10-LC thấp hơn so với NN01-YB.
Nghiên cứu của Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Nguyễn Văn Tuân (2007) đã chỉ ra hàm lượng protein tan tổng số của 11 giống đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng dao động từ 20,99-26,75%. Như vậy, hàm lượng protein của đậu Nho nhe trong nghiên cứu này khác so với kết quả đã công bố.
3.2.2. Hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe
α-amylase là enzyme tham gia thuỷ phân tinh bột tạo thành đường. Đường tạo thành có vai trò làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào, từ đó làm tăng tính chống chịu của thực vật với các yếu tố cực đoan từ môi trường, giúp cây non phát triển bình thường. Hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe NN01-YB ở giai đoạn 2-3 ngày tuổi lần lượt đạt 1,0; 1,2 U/mg. Hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe NN10-LC ở giai đoạn 2-3 ngày tuổi lần lượt đạt 1,0; 1,14 U/mg. Như vậy, mầm hạt đậu Nho nhe trong nghiên cứu có khả năng sinh ra α-amylase.
So sánh hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe trong nghiên cứu này với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Nguyễn Văn Tuân (2007) trên đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng sau 5 ngày. Kết quả nhận thấy, hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe trong nghiên cứu này cao hơn so với đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng hoạt tính enzyme dao động từ 0,573-0,941 U/mg protein.
3.2.3. Hoạt tính protease từ mầm đậu Nho nhe
Protease là một enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình nảy mầm của hạt, sự phát triển của cây non và có liên quan đến khả năng chịu mất nước của tế bào. Nghiên cứu hoạt tính protease từ mầm đậu Nho nhe nhằm đánh giá mối liên quan với
hàm lượng protein có trong hạt. Kết quả khảo sát nhận thấy, hoạt tính protease ở thời gian hạt nảy mầm 2-3 ngày tuổi lần lượt đạt 2,0 và 2,2 U/mg ứng với đậu Nho nhe trồng tại Yên Bái NN01-YB. Hoạt tính protease đối với hạt nảy mầm 2-3 ngày tuổi lần lượt đạt 1,4 và 2,0 U/mg đối với đậu Nho nhe trồng tại Lai Châu NN10-LC. Kết quả nghiên cứu này cũng thể hiện mối tương quan với hàm lượng protein tổng số có trong hạt và liên quan tới tốc độ nảy mầm của hạt.
3.2.4. Hàm lượng isoflavone từ mầm hạt đậu Nho nhe
Isoflavone là các polyphenolkhông màu thuộc lớp flavonoid. Isoflavone trong đậu tương gồm daidzein, genistein và glycitein được tổng hợp thông qua con đường phenypropanoid với sự tham gia của nhiều enzyme, trong đó có hai loại enzyme quan trọng tham gia tổng hợp isoflavone được biết đến là chalcone isomerase và isoflavone synthase. Các chất này chỉ khác nhau về nguyên tử hydro và các nhóm hydroxyl. Genistein chỉ khác daidzein ở nhóm hydroxyl liên kết với carbon số 5. Daidzein và genistein là những chất isoflavone phổ biến nhất, có cấu trúc hóa học đặc trưng.
Bảng 3.2. Hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi
của 2 mẫu đậu Nho nhe
Isoflavone NN01-YB (µg/100g hạt) NN10-LC (mg/100g hạt) Daidzein 3,190,22 4,210,05 Genistein 0 0
Isoflavone (daidzein + genistein) 3,19 41,28
Sử dụng kỹ thuật phân tích HPLC định lượng daidzein và genistein chiết từ hạt đậu Nho nhe nảy mầm 3 ngày tuổi từ sắc ký đồ ở hình 3.5 và phương trình đường chuẩn kết quả phân tích HPLC được thể hiện ở bảng 2.3. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, ở mẫu đậu Nho nhe NN10-LC, trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi có hàm lượng daidzein đạt 4,21 mg/100g và hàm lượng genistein không có. Trong khi, mẫu đậu Nho nhe NN01-YB hàm lượng daidzein khá nhỏ, hàm lượng đạt 3,19 µg/100g hạt và hàm lượng genistein không có. Hàm lượng daidzein và genistein của 2 mẫu đậu Nho nhe có sự khác biệt ở mức ý nghĩa
phân tích cho thấy isoflavone trong mầm hạt đậu Nho nhe của Lai Châu và Hà Giang chỉ có một nhóm chất là daidzein. AU 0.00 0.05 0.10 0.15 Minutes 5.00 10.00 15.00 20.00 A 1 6 .9 3 8 - 8 9 5 9 0 1 AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 B
Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ mầm hạt đậu Nho nhe sau 3 ngày tuổi
A: Nho nhe NN01-YB; B: Nho nhe NN10-LC
Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa sinh của 2 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC cho thấy hàm lượng protein, hoạt tính α-amylase, protease và hàm lượng isoflavone giữa 2 mẫu có sự khác nhau được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Đặc điểm hóa sinh của 02 mẫu đậu Nho nhe
3.3. Đặc điểm của vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho Nhe
Mẫu đậu Nho nhe thu tại tỉnh Yên Bái và tỉnh Lai Châu được nhận diện dựa trên vùng gen ITS. Tiến hành tách DNA tổng số từ mầm cây đậu Nho nhe được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose và đo quang phổ, kết quả DNA thu được đảm bảo chất lượng cho phản ứng nhân gen.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số 1: Vùng gen ITS từ đậu Nho nhe NN01-YB, 2: Vùng gen ITS từ đậu
Vùng gen ITS từ cây đậu Nho nhe được phân lập bằng phản ứng PCR từ DNA hệ gen sử dụng cặp mồi đặc hiệu trong bảng 2.3. Sau khi điện di kiểm tra, sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 460 bp (Hình 3.6) ứng với vùng gen ITS từ cây đậu Nho nhe thu tại tỉnh Yên Bái và Lai Châu.
A
B
Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC được xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer có kích thước là 458 nucleotide (Hình 3.7).
A
B
Hình 3.8. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS của mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với một số trình tự vùng
Bằng phần mềm BLAST trong NCBI cho thấy, vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho nhe NN10-LC và NN01-YB ở Việt Nam có tỷ lệ tương đồng lần lượt là 100% và 99% so với trình tự vùng gen ITS của loài Vigna umbellata trên GenBank có mã số KX087818 (Hình 3.8).
A
B
Hình 3.9. Trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN10-LC (A) và NN01-YB (B) với trình tự vùng gen ITS mang mã số KX087818 trên GenBank
Như vậy, kết quả so sánh bằng BLAST trong NCBI đã khẳng định được trình tự đoạn DNA phân lập từ hai mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC là trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ loài đậu Nho nhe Vigna umbellata ở Việt Nam.
Kết quả so sánh trình tự nucleotit của vùng gen ITS của hai mẫu đậu Nho nhe với trình tự vùng gen ITS mang mã số KX087818 được trình bày ở Hình 3.9. So sánh trình tự vùng gen ITS của 2 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC, nhận thấy trình tự vùng gen ITS của 2 mẫu này có độ tương đồng 99,6%; có sự khác nhau về trình tự nucleotide tại 02 vị trí số 30 (T thay bằng A) và số 37 (G thay bằng C).
Tiến hành phân tích mối quan hệ giữa các loài đậu thuộc chi Vigna dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS công bố trên GenBank bằng phần mềm MegAlign, kết quả xác định được hệ số tương đồng, hệ số phân ly và sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các cây đậu Nho nhe ở Việt Nam với các loài thuộc chi Vigna trên thế giới. Các trình tự vùng gen ITS sử dụng phân tích được thống kê gồm 5 loài
V. umbellata (KX087818.1), V. angularis (JF421525.1), V. Glabrescens
(KX087721.1), V. hirtella (KX087729.1) và V. reflexopilosa (KX087791.1). Kết quả cho thấy hệ số tương đồng từng cặp so sánh dao động từ 96,6-99,6%; hệ số phân ly dao động từ 0,2-3,3%. Hai trình tự vùng gen ITS của mẫu NN01-YB và NN10-LC có hệ số tương đồng là 99,6%; và tương đồng 98,6-99,1% với loài đậu Nho nhe V. umbellata (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên GenBank
Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây đậu Nho nhe dựa trên trình tự vùng gen
ITS và 5 loài trên GenBankđược thể hiện ở hình 3.10. Như vậy, 2 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC trong nghiên cứu có tên khoa học là Vigna umbellata.
Hình 3.10. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC với trình tự vùng gen ITS trên GenBank
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xác định được đặc điểm hình thái rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt và đặc điểm giải phẫu rễ, thân, lá của 2 mẫu đậu Nho nhe NN01-YB thu tại tỉnh Yên Bái và NN10-LC thu tại tỉnh Lai Châu là giống nhau.
Hàm lượng protein tan tổng số của mẫu đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC lần lượt đạt 30,3 mg/100g hạt và 29,1 mg/100g hạt. Hoạt tính α-amylase có trong mầm hạt đậu Nho nhe của mẫu NN01-YB và NN10-LC lần lượt đạt 1,0-1,2 và 1,0- 1,14 U/mg. Hoạt tính protease trong mầm hạt đậu Nho nhe của mẫu NN01-YB và NN10-LC lần lượt đạt 2,0-2,4 và 1,4-2,0 U/mg. Isoflavone trong mầm mẫu đậu hạt đậu Nho nhe NN01-YB và NN10-LC 3 ngày tuổi chỉ chứa daidzein (NN01-YB đạt 3,19 µg/100g hạt, NN10-LC đạt 4,21 mg/100g) và không có genistein.
Vùng gen ITS đã được phân lập và giải trình tự có độ dài 458 nucleotit và khẳng định mẫu đậu nho nhe thu tại Yên Bái và Lai Châu thuộc loài Vigna umbellata.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc điểm sinh học của giống đậu Nho nhe Yên Bái và Lào Cai để cung cấp đầy đủ các thông tin về giống.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Tiến Bân (2013), Danh sách loài thực vật ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây Cỏ Việt Nam, Nxb trẻ, Tp Hồ Chí Minh, 1, tr.597.
3. Nguyễn Thị Lang (2007), “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu nành bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR”, Tạp chí công nghệ sinh học, 5(2), tr 233-245.
4. Phạm Thị Ngọc, Nguyễn Quốc Trung, Vũ Văn Liết (2016), “Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu giống đậu Cô ve bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR”, Tạp chí KH Nông nghiệp Việt Nam, 14 (12), tr. 1874-1885.
5. Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga (2008), “Hình thái - giải phẫu học thực vật”, Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội, Tr. 14.
6. Vũ Thanh Trà (2012), “Đánh giá sự đa dạng di truyền của 50 giống đậu tương Việt Nam có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt bằng chỉ thị SSR”, Tạp chí Sinh học, 34(2), tr 235-240.
7. Lê Quang Vĩnh (2009), “Theo dõi sự phát triển của một số loại cây phân xanh họ đậu trồng xen với cây trồng lâm nghiệp trên vùng gò đồi ở trại Hương Vân, huyện Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, 55, tr.123-129.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. Anson M. L. (1938), The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin, J. Gen. Physiol., 22, pp. 79-89.
9. Ba FS, Remy SP, Paul G. 2004. Genetic diversity in cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] as revealed by RAPD markers. Genetic Resources and Crop Evolution 51: 539-550.
10. Chen H, Chen X, Tian J, Yang Y, Liu Z, Hao X, et al. (2016) Development of Gene-Based SSR Markers in Rice Bean (Vigna umbellata L.) Based on
Transcriptome Data. PLoS ONE 11(3): e0151040.
doi:10.1371/journal.pone.0151040.
11. Chen SL, Yao H, Han JP, Liu C, Song JY, Shi LC, Zhu YJ, Ma XY, Gao T, Pang XH, et al. 2010. Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species. PLoS One 5 (1). doi:Artn E8613.
12. Gopalan C, Ramasastri BV and Balasubramanian SC. 1991. Nutritive value of Indian foods. Revised and Updated by National Institute of Nutrition, ICMR, Hyderbad .p 47.
13. Group CPW, Hollingsworth PM, Forrest LL, Spouge JL, Hajibabaei M, Ratnasingham S, van der Bank M, Chase MW, Cowan RS, Erickson DL, et al. 2009. A DNA barcode for land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences 106: 12794-12797.
14. Igbedioh SO, Shaire S and Aderiye BJI. 1995. Effects of Processing on Total Phenols and Proximate Composition of Pigeonpean {Cajanus cajan) and Climbing Bean (Vigna umbellata). Journal of Food Science and Technology 32(6): 497-500.
15. Kang JH, McRoberts J, Shi F, Moreno JE, Jones AD, Howe GA (2014), “The flavonoid biosynthetic enzyme chalcone isomerase modulates terpenoid production in glandular trichomes of tomato”, Plant Physiology, 164, pp.1161- 1174.
16. Katoch R. 2011. Morpho-physiological and nutritional characterization of rice bean (Vigna umbellata) Acta Agronomica Hungarica. 59(2): 125.
17. Khabirruddin M, Gupta SN and Tyagi CS. 2002.Nutritional composition of some improved genotypes of rice bean (Vigna umbellata). Forage Research 28(2): 104-104.
18. Kochhar S and Hira CK. 1997. Nutritional and cooking quality evaluation of green gram (Vigna radiata L.) cultivars. Journal of Food Science and Technology 34(4): 328-330.
19. Miller G. L., (1959), Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars, Anal. Chem., 31, pp. 426-428.
20. Negi A, Boora P and Kheteapaul N. 2001. Starch and protein digestibility of newly released moth bean cultivars : effect of soaking , dehulling , germination and pressure cooking. Nahrung/Food 45(4): 251-254.
21. Priya Smriti. 2005. Biochemical characterization of promising rice bean (Vigna umbellata) germplasm./W.Sc. Thesis. Deptt of Chemistry and Biochemistry, CSK HPKV. Palampur.p 40.
22. Raiger HL, Bhandari BC and Phogat BS. 2010. Annual report of All India Coordinated Research Network on Under-utilized crops NBPGR, New Delhi.p.408.
23. Raveendar S, Lee JR, Park JW, Lee GA, Jeon YA, Lee WH, Cho GT, Ma KH, Lee SY, Chung JW. 2015. Identification of Genus Vigna using ITS2 and matK as a Two-Locus DNA Barcode. Plant Breed. Biotech. 3(2):153-159.
24. Sadana B,. Hira CK, Singal N and Gerwal H. 2006. Nutritional evaluation of rice bean (Vigna umbellata) strains. Journal of Food Science and Technology 43(5): 516-518.
25. Saharan K, Khetarpaul N and Bishnoi S. 2004. Contents and digestibility of carbohydrates of rice bean and fababean as affected by simple inexpensive processing method. Nutrition and Food Science 34 (1): 13-16.
26. Saikia P, Sarkar CR and Borua I. 1999. Chemical composition, anti-utritional factor and effect of cooking on nutritional quality of rice bean [Vigna umbellata
(Thunb). Ohwi and Ohashi]. Food Chemistry 50(4): 347-352.
27. Sharma P. 2002. Effect of incorporation of full fat and defatted legume flours on the acceptability and nutritional quality of maize products. M.Sc. Thesis . Depff of Food Sciences and Nutrition, CSK.HPKV, Palampur (H.P).
28. Srivastava RP, Srivastava GK and Gupta RK. 2001. Nutritional quality of rice bean [Vigna umbellate (Thunb) Ohwi and Ohashi]. Indian Journal of Agricultural Biochemistry 14(1/2): 55-56.
29. Velazquez ER, Silva L, Alvaro P. 2010. Legumes: a healthy and ecological source of flavonoids. . Curr Nutr Food Sci 6: 109-144.