a. Húa chất và thiết bị cho tỏch chiết ADN
STT Tờn hoỏ chất thiết bị
1 Dung dịch Chelex 100, nồng độ 5%
2 Block nhiệt khụ cho ống 1,5ml (1000C) kốm nhiệt kế 3 Mỏy li tõm ống 1,5ml 14.000v/p
4 Tủ an toàn sinh học 5 Ống tỏch chiết 1,5ml
b. Húa chất và thiết bị cho định lƣợng ADN
1 Quantifiler Human DNA quantification Kit (hóng Applied Biosystems)
2 Optical plate 96 well 3 Optical seal
4 Mỏy Realtime PCR 7500 (hóng Applied Biosystems)
5 Cỏc loại đầu tớp 10 àl, 200 àl và 1000 àl cựng pipet tương ứng
c. Húa chất và thiết bị cho nhõn bội và điện di
STT Tờn hoỏ chất thiết bị
1 Mỏy giải trỡnh tự Applied Biosystems 3130 2 Mỏy PCR 9700 96 well Applied biosystems 3 Kit Identifiler của hóng Applied biosystems 4 POP 4 (ABI)
5 Liz 500 Gene scan 6 HIDI formamide
7 Buffer 10X for AB - 3130 8 Capilary 3130 (36cm x 50ul) 9 Optical plate 96 well
10 Septa
11 Ống PCR (0,25 ml) và điện di (0,5 ml)
2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
Luận văn sử dụng cỏc phương phỏp nghiờn cứu sau:
- Phương phỏp lấy ý kiến chuyờn gia:Tham khảo phương phỏp thu mẫu, thu số liệu và sử lý số liệu
- Phương phỏp thu mẫu ngẫu nhiờn đảm bảo cỏc điều kiện theo định luật Hardy - Weinberg.
- Phương phỏp thực nghiệm khoa học: phõn tớch kiểu gen 120 cỏ thể theo quy trỡnh giỏm định ADN của Viện Khoa học hỡnh sự.
- Phương phỏp thống kờ số liệu sinh học để tớnh tần suất cỏc alen trong hệ Identifiler của dõn tộc Nựng.
2.2.1. Quy trỡnh phõn tớch ADN
Chỳng tụi tiến hành phõn tớch theo quy trỡnh giỏm định ADN của Viện Khoa học hỡnh sự đó được chuẩn húa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục b của Luật Giỏm định tư phỏp 2012, gồm cỏc bước sau:
Tỏch chiết ADN (phương phỏp vụ cơ) Định lượng ADN (phương phỏp Real-time PCR) Nhõn bụ ̣i ADN (PCR) (bộ Kit Identifiler) Điện di mao quản
(Mỏy AB3130) Phõn tớch kết quả
2.2.2. Xử lý thống kờ số liệu và tớnh tần suất cỏc locus gen
2.2.2.1. Cơ sở lý thuyờ́t
Đờ̉ sụ́ liờ ̣u nghiờn cứu vờ̀ các locus gen sử du ̣ng được cho những ứng du ̣ng cụ thể, điờ̀u cõ̀n thiờ́t đõ̀u tiờn là cần đỏnh giỏ xem mẫu n ghiờn cứu với locus gen được phõn tích có đảm bảo rằng cṍu trúc di truyờ̀n của mõ̃u (tõ̀n sụ́ tương đụ́i của các alen và tõ̀n sụ́ các kiờ̉u gen ) là ổn định hay khụng qua cỏc thế hệ , nghĩa là mẫu cú tuõn theo định luật Hardy - Weinberg hay khụng ?[2, 7, 36]
Do đó cõ̀n kiờ̉m tra sự phù hợp giữa mõ̃u với quõ̀n thờ̉ cõn bằng lý thuyờ́t thụng qua đánh giá chờnh lờ ̣ch giữa tõ̀n sụ́ quan sát thực tờ́ với phõn bụ́ lý thuyờ́t của các kiờ̉u gen của mụ̃i locus gen được ng hiờn cứu có sai khác nhau hay khụng? [4, 36]
2.2.2.2. Phương phá p xử lý thụ́ng kờ
Kiờ̉m đi ̣nh sự phù hợp phõn bụ́ tõ̀n sụ́ kiờ̉u gen giữa mõ̃u khảo sỏt và quõ̀n thờ̉ lý thuyờ́t dựa vào tiờu chuõ̉n Khi bỡnh phương 2
[13, 36].
Đỏnh giỏ sự phự hợp giữa số liệu thực nghiệm và giả thuyờ́t lý thuyết theo phương phỏp kiểm định 2
ta dựng chỉ số sau để tớnh 2
thực tế (2 TT):
(2.1) Trong đú : * k là số lớp của dóy số liệu thực nghiệm.
* nij là số kiểu gen AiAj quan sỏt được trong một locus gen. * Eij là số kiểu gen AiAj tớnh toỏn theo lý thuyết.
Eij = npi 2
nếu i=j, Eij = 2npipj nếu i ≠ j Tra giỏ trị 2
lý thuyết (2
k(k-1)/2 (2.2) Quy tắc kiểm định 2
là trong một locus gen số lượng kiểu gen quan sỏt dưới 5, thỡ phải kết hợp cỏc alen bờn cạnh để tăng số lượng quan sỏt cao hơn 5 để tớnh toỏn.
2.2.2.3. Cỏc bước tớnh toỏn thống kờ và kiểm định
- 120 kiểu gen cða 120 cá thể người Nùng được thống kê tần số kiểu gen, tần số alen.
- Tớnh tần suất cỏc alen của mỗi locus theo số liệu thu được trong nghiờn cứu. - Xỏc định số kiểu gen thực tờ́ của mõ̃u khảo sỏt (số lượng kiểu gen AiAj cho từng locus ).
- Xỏc định số ki ểu gen lý thuyết Eij (số lượng kiểu gen AiAj cho từng locus được giả thiết tuõn theo định luật Hardy - Weinberg).
- Tớnh chỉ số kiểm định 2
theo cụng thức.
- Xỏc định khi bình phương tiờu chuõ̉n (α) theo mứ c xác suṍt p =0.05 (tra bảng).
- So sánh giá t rị khi bỡnh phương tớnh được với khi bỡnh phương tiờu chuõ̉n: Nờ́u khi bình phương tính được nhỏ hơn 2
tiờu chuõ̉n thì phõn bụ́ thực tờ́ phù hợp với phõn phụ́i lý thuyờ́t , nghĩa là mẫu phự hợp với quần thể lý thuyờ́t [7, 8, 11, 13].
- Cỏc số liệu thống kờ và tớnh toỏn trờn phần mềm Microsoft Office Excel 2003.
Trong chương II luận văn trỡnh bày cỏc bước thu thập và bảo quản mẫu đỳng với qui trỡnh tiờn tiến tại cỏc phũng thớ nghiệm giỏm định ADN của cỏc nước trờn thế giới. Cựng với đú là qui trỡnh giỏm định ADN của Viện Khoa học hỡnh sự đó được chuẩn húa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục b Luật Giỏm định tư phỏp 2012.
Sử dụng phương phỏp thống kờ phổ biến trong nghiờn cứu Sinh học, do quần thể nghiờn cứu lớn nờn chọn phương phỏp kiểm định 2
là phự hợp.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phõn tớch kiểu gen của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập.
3.1.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tỏch chiết ADN
- Thu ngẫu nhiờn được 120 mẫu mỏu của 120 người Nựng trờn thẻ thu mẫu FTA và bảo quản theo quy định tại phũng thớ nghiệm ADN của Viện Khoa học hỡnh sự (phụ lục 1).
- Mẫu mỏu sau khi thu được tiến hành tỏch chiết ADN theo phương phỏp vụ cơ, định lượng ADN theo phương phỏp Realtime PCR. Do điều kiện thu mẫu tương đối tương đồng về cỏc mặt khỏch quan như cỏn bộ thu mẫu, vật liệu thu mẫu và thời gian thu, bảo quản mẫu và sử dụng mỏy đục lỗ (Punching) để lấy mẫu với kớch thước giống nhau nờn trong thực nghiệm chỉ tiến hành định lượng 10 mẫu ngẫu nhiờn từ 120 mẫu mỏu thu trờn thẻ FTA và cho kết quả như sau:
Bảng 3.1: Kết quả định lƣợng ADN bằng phƣơng phỏp Realtime PCR
Mẫu N 1 N 5 N 10 N 18 N 26 N 67 N 73 N 87 N 95 N 120 Nồng
độ ADN
(ng/àl)
8,9 9,3 10,6 8,8 9,7 11,6 10,2 9,6 8,3 10 Theo đú, ước tớnh nồng độ ADN trung bỡnh tỏch chiết từ 120 mẫu là 9,7 ng/àl. Đủ điều kiện ADN đầu vào để thực hiện phản ứng PCR.
3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phõn tớch kiểu gen
Toàn bộ 120 sau khi tỏch chiết AND phản ứng PCR với bộ kit Identifiler (thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt theo nhà sản xuất) phản ứng PCR được
thực hiện trờn mỏy PCR 9700. Sau khi chạy phản ứng PCR, toàn bộ 120 mẫu được chạy điện di trờn mỏy giải trỡnh tự ADN ABI 3130 và phõn tớch kiểu gen bằng phần mềm GenemaperID v3.2.
3.2. Tớnh tần suất của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập đƣợc
3.2.1. Kết quả tớnh tần suất cỏc alen
Từ 120 kiểu gen hệ Identifiler, chỳng tụi đó thống kờ được tổng số 3600 alen, gồm 50 loại alen (từ 6 đến 35.2) với tần suất và số loại alen ở từng locus gen là khỏc nhau (phụ lục 2, 3).
3.2.2. So sỏnh chỉ số kiểm định 2 giữa tớnh toỏn (2
tt) với lý thuyết (2
lt) và đỏnh giỏ sự phự hợp với định luật Hardy - Weinberg
Tổng hợp cỏc chỉ số 2
TT (tớnh theo cụng thức 2.1) cho từng locus gen, tra bảng phõn phối 2 theo hệ số tự do (tra bảng theo cụng thức 2.2) , ta được kết quả như sau:
Bảng 3.2: So sỏnh 2 TT và 2 LT Locus 2 TT 2 LT D8S1179 10.93 25 D21S11 7.03 7.81 D7S820 5.07 7.81 CSF1PO 3.34 7.81 D3S1358 5.61 7.81 TH01 0.07 3.84 D13S317 3.43 12.59 D16S539 6.41 7.81 D2S1338 3.98 7.81 D19S433 4.43 7.81 vWA 2.06 12.59 TPOX 2.39 7.81 D18S51 4.73 7.81 D5S818 2.84 7.81 FGA 8.58 12.59
Theo bảng trờn ta thấy ở tất cả cỏc locus gen kể trờn, giỏ trị 2
tt < 2 lt tức là giả thiết tần suất phõn bố cỏc alen của 15 locus gen hệ Identifiler trong quần thể người dõn tộc Nựng tuõn theo định luật Hardy - Weinberg được chấp nhận với độ tin cậy là 95%.
Như vậy tần suất phõn bố cỏc alen của 15 locus gen hệ Identifiler trong 120 mẫu khảo sỏt kể trờn cú thể được ứng dụng để tớnh toỏn xỏc suất trong quỏ trỡnh giỏm định ADN.
3.2.3. So sỏnh tần suất alen của người Nựng với một số dõn tộc
Từ bảng thống kờ tần suất alen của cỏc locus gen hệ Identifiler của dõn tộc Nựng, so sỏnh với dõn tộc Kinh và người gốc Mỹ [15, 18] cho thấy cú sự khỏc biệt giữa cỏc dõn tộc người về số lượng alen xuất hiện và tần suất của từng alen. Dưới đõy là bảng so sỏnh tần suất alen ở từng locus:
a) Locus D8S1179
Bảng 3.3: Tần suất alen (%) của locus D8S1179
Alen Dõn tộc Nựng (n = 120) Dõn tộc Kinh (n= 170) Ngƣời gốc Mỹ (n = 191) 8 - 0.59* 0.52 9 - - 0.26* 10 15.8** 17.06** 4.71 11 15.4 15.00 3.40 12 15.8** 14.71 11.52 13 15.4 14.71 37.43** 14 13.8 15.59 30.36 15 15 11.76 9.42 16 6.7 7.06 1.57 17 1.2 2.94 0.52 18 0.8* 0.59* -
Nhận xột:
Đối với quần thể người dõn tộc Nựng: xuất hiện 09 alen với tần suất của alen 18 là thấp nhất (0,8%) và tần suất của alen 10 và 12 là cao nhất (15.8%). - Đối với quần thể người dõn tộc Kinh: xuất hiện 10 alen với tần suất của alen 8 và 18 là thấp nhất (0,59%) và tần suất của alen 10 là cao nhất (17%).
- Đối với quần thể người gốc Mỹ: xuất hiện 10 alen với tần suất của alen 9 là thấp nhất (0,26%) và tần suất của alen 13 là cao nhất (37.43%).
Như vậy, alen 13 ở locus D8S1179 của người gốc Mỹ là alen phổ biến trong quần thể (hơn 1/3 dõn số), trong khi đú ở người dõn tộc Nựng và người dõn tộc Kinh thỡ alen phổ biến nhất lại là 10 và 12 nhưng tần suất thấp hơn (chỉ khoảng 1/6 dõn số).
b) Locus D21S11
Bảng 3.4: Tần suất alen (%) của locus D21S11
Alen Dõn tộc Nựng (n = 120) Dõn tộc Kinh (n= 170) Ngƣời gốc Mỹ (n = 191) 26 - 0.294* - 27 - 0.588 0.52 28 2.1 5.588 6.28 29 28.8** 27.3** 16.75 29.2 0.4* - 0.26* 30 21.2 25.00 34.29** 30.2 1.7 2.059 1.83 31 9.6 8.235 5.76 31.2 11.2 5.588 18.85 32 5 2.353 0.79 32.2 17.1 18.235 9,69 33 3.3 0.294* 0.52 33.2 21.2 4.706 3.66 34.2 - - 0.79
Nhận xột:
- Đối với quần thể người dõn tộc Nựng: xuất hiện 11 alen với tần suất của alen 29.2 là thấp nhất (0,4%) và tần suất của alen 29 là cao nhất (28.8%).
- Đối với quần thể người dõn tộc Kinh: xuất hiện 12 alen với tần suất của alen 26 và 33 là thấp nhất (0,294%) và tần suất của alen 29 là cao nhất (27.3%).
- Đối với quần thể người gốc Mỹ: xuất hiện 13 alen với tần suất của alen 29.2 là thấp nhất (0,26%) và tần suất của alen 30 là cao nhất (34.29%).
Ở locus D21S11, khụng thấy xuất hiện alen 26 và 27 đối với dõn tộc Nựng, trong khi đú ở dõn tộc Kinh thỡ cú xuất hiện. Alen 34.2 là alen đặc trưng của người gốc Mỹ, khụng thấy xuất hiện ở người dõn tộc Nựng và dõn tộc Kinh.
c) Locus D7S820
Bảng 3.5: Tần suất alen (%) của locus D7S820
Alen Dõn tộc Nựng (n = 120) Dõn tộc Kinh (n= 170) Ngƣời gốc Mỹ (n = 191) 7 8 0.882 0.52* 8 12.1 14.706 13.09 9 4.2 5.588 8.12 (9+) - 0.294* - 10 17.9 20.588 21.99 11 41.2** 34.412** 28.80** 12 20.8 20.294 24.08 13 02.5 2.353 3.40 14 0.4* 0.882 -
Nhận xột:
Đối với quần thể người dõn tộc Nựng: xuất hiện 8 alen với tần suất của alen 14 là thấp nhất (0,4%) và tần suất của alen 11 là cao nhất (41.2.4%).
- Đối với quần thể người dõn tộc Kinh: xuất hiện 9 alen với tần suất của alen 9+ là thấp nhất (0,294%) và tần suất của alen 11 là cao nhất (34.412%).
- Đối với quần thể người gốc Mỹ: xuất hiện 7 alen với tần suất của alen 7 là thấp nhất (0,52%) và tần suất của alen 11 là cao nhất (28.8%).
Với locus D7S820, quần thể người dõn tộc Nựng, dõn tộc Kinh quần thể và người gốc Mỹ khỏ tương đồng về số lượng cỏc alen và cựng cú alen 11 là alen phổ biến. Với alen 9+ (là alen cú peak xuất hiện ở giữa peak của alen 9 và 9.2) là alen đặc trưng của quần thể người dõn tộc Kinh.
d) Locus CSF1PO
Bảng 3.6: Tần suất alen (%) của locus CSF1PO
Alen Dõn tộc Nựng (n = 120) Dõn tộc Kinh (n= 170) Ngƣời gốc Mỹ (n = 191) 7 2.1 0.588* - 8 - - 0.52* 9 2.1 4.706 8.38 10 23.3 24.706 30.89 11 27.5 25.882 21.00 12 39.6** 34.706** 32.72** 13 4.6 6.765 4.71 14 0.8* 2.059 0.79 15 - 0.588* -
(*: tần suất alen thấp nhất **: tần suất alen cao nhất)
Nhận xột:
Đối với quần thể người dõn tộc Nựng: xuất hiện 7 alen với tần suất của alen 14 là thấp nhất (0,8%) và tần suất của alen 12 là cao nhất (39.6%).
- Đối với quần thể người dõn tộc Kinh: xuất hiện 8 alen với tần suất của alen 7 và 15 là thấp nhất (0,588%) và tần suất của alen 12 là cao nhất (34.706%).
- Đối với quần thể người gốc Mỹ: xuất hiện 7 alen với tần suất của alen 8 là thấp nhất (0,52%) và tần suất của alen 12 là cao nhất (28.8%).
Với locus CSF1PO, alen 7 đều xuất hiện ở cả 2 dõn tộc Việt, trong khi đú lại khụng xuất hiện ở quần thể người gốc Mỹ. Ngược lại, alen 8 xuất hiện ở quần thể người gốc Mỹ nhưng lại khụng xuất hiện ở cả 2 dõn tộc Việt. Alen 12 là alen phổ biến ở cả 3 dõn tộc.
e) Locus D3S1358
Bảng 3.7: Tần suất alen (%) của locus D3S1358
Alen Dõn tộc Nựng (n = 120) Dõn tộc Kinh (n= 170) Ngƣời gốc Mỹ (n = 191) 11 - - 0.26* 14 3.8 3.824 6.81 15 27.9 31.471** 40.84** 16 34.6* 35.00 32.98 17 26.2 20.294 9.95 18 6.7 8.235 8.38 19 0.8* 0.882 0.79 20 - 0.294* -
(*: tần suất alen thấp nhất **: tần suất alen cao nhất)
Nhận xột:
Đối với quần thể người dõn tộc Nựng: xuất hiện 06 alen với tần suất của alen 19 là thấp nhất (0,8%) và tần suất của alen 16 là cao nhất (34.6%).
- Đối với quần thể người gốc Mỹ: xuất hiện 7 alen với tần suất của alen 11 là thấp nhất (0,26%) và tần suất của alen 15 là cao nhất (40.84%).
Ở locus D3S1358, tớnh đa hỡnh khỏ thấp đối với quần thể người dõn tộc Nựng: xuất hiện 6 alen nhưng phổ biến chỉ là 3 alen với tổng số 88.7%.
f) Locus THO1
Bảng 3.8: Tần suất alen (%) của locus THO1
Locus / Alen Dõn tộc Nựng (n = 120) Dõn tộc Kinh (n= 170) Ngƣời gốc Mỹ (n = 191) 6 8.3 14.118 20.68 7 30.8 36.176** 43.98** 8 5.4 6.765 5.24 8.3 0.4* - - 9 42.1** 32.647 6.28 9.3 3.3 3.824 23.56 10 9.6 5.882 0.26* 11 - 0.588* -
(*: tần suất alen thấp nhất **: tần suất alen cao nhất)
Nhận xột:
Đối với quần thể người dõn tộc Nựng: xuất hiện 7 alen với tần suất của alen 8.3 là thấp nhất (0,4%) và tần suất của alen 9 là cao nhất (42.1%).
- Đối với quần thể người dõn tộc Kinh: xuất hiện 7 alen với tần suất của alen 11 là thấp nhất (0,588%) và tần suất của alen 7 là cao nhất (36.176%).
- Đối với quần thể người gốc Mỹ: xuất hiện 6 alen với tần suất của alen 10 là thấp nhất (0,26%) và tần suất của alen 7 là cao nhất (43.98%).
Ở locus THO1, người dõn tộc Nựng và dõn tộc Kinh cú alen 9 là alen rất phổ biến trong quần thể, ngược lại alen 9 ở người gốc Mỹ lại rất thấp.
g) Locus D13S317
Bảng 3.9: Tần suất alen (%) của locus D13S317
Locus / Alen Dõn tộc Nựng (n = 120) Dõn tộc Kinh (n= 170) Ngƣời gốc Mỹ (n = 191) 7 0.8* 0.294* - 8 32.9** 34.118** 4.97 9 15.8 13.235 17.80 10 12.9 12.353 13.61 11 24.2 22.353 24.35** 12 11.2 13.529 23.04 13 2.1 2.941 7.85 14 - 1.176 8.12 15 - - 0.26*
(*: tần suất alen thấp nhất **: tần suất alen cao nhất)
Nhận xột:
Đối với quần thể người dõn tộc Nựng: xuất hiện 7 alen với tần suất của alen 7 là thấp nhất (0,8%) và tần suất của alen 8 là cao nhất (32.9%).
- Đối với quần thể người dõn tộc Kinh: xuất hiện 8 alen với tần suất của alen 7 là thấp nhất (0,294%) và tần suất của alen 8 là cao nhất (34.118%).
- Đối với quần thể người gốc Mỹ: xuất hiện 8 alen với tần suất của alen 15 là thấp nhất (0,26%) và tần suất của alen 11 là cao nhất (24.35%).
Locus D13S317 cú sự phõn bố cỏc alen ở 2 dõn tộc Việt rất khỏc biệt so với người gốc Mỹ. Cả dõn tộc Nựng và Kinh cú alen 8 rất phổ biến, trong khi