Theo thiết ế cặp mồi DWV-VP1F 5‟-GTA GGT TAT GTG CCT GGT TTG A-3‟ và DWV_VP1R: 5‟-GTTGCCAATGGTGCACGCATG-3‟ sẽ nhân v ng đoạn DNA đặc hiệu DWV với ch thước 786 bp. Để iểm tra t nh đặc hiệu của cặp mồi chúng t i tiến hành phản ng RT-PCR với 5 mẫu RNA dương t nh chuẩn và 2 mẫu RNA âm t nh chuẩn (RNA của virus SBV và BQCV). Kết quả phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (Hình 3.2) cho thấy tất cả c c mẫu dương t nh chuẩn xuất hiện duy nhất 1 băng DNA có ch thước khoảng 750 bp. Trong hi đó tất cả c c mẫu đối ch ng âm h ng cho sản phẩm PCR. Kết quả này bước đ u hẳng đ nh cặp mồi chúng t i thiết ế là đặc hiệu cho đoạn DNA của DWV. Để chắc chắn đoạn nucleotide được nhân lên là của DWV, chúng tôi tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi DWV-VP1-F và DWV-VP1-R. M : Thang chỉ th DNA 1kb; 1: RNA mẫu ong nhiễm Sacbrood virus; 2: RNA mẫu ong nhiễm Black Queen Cell virus; 3-7: RNA từ mẫu ong nhiễm Deformed Wing virus.
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng ph n m m Bioedit trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của đoạn gen VP1 được mô tả
trong hình 3.3. Đoạn DNA được giải trình tự bao gồm 786 nucleotide tương
ng với ch thước lí thuyết mà chúng t i đã thiết kế. Do chúng tôi chỉ thiết kế cặp mồi để chuẩn đo n virus mà h ng tiến tới biểu hiện gen nên trình tự chúng t i thu được là trình tự không hoàn chỉnh của gen VP1.
M 1 2 3 4 5 6 7
Sản phẩm PCR 1kb