15 DK5Fb 5' AGTGATGTAATACCAATGAATTGG-3’ Mồi xuô
2.2.6.3. Dòng hóa vào vector pCR®2.1TOPO (lai đầu dính)
Do sản phẩm PCR (sử dụng enzyme Taq DNA polymerase xúc tác tổng hợp) thường được gắn thêm Adenine (A) ở đầu 3’, nên khi nối với vector có đầu lồi là Thymine (T) đã được các hãng sinh phẩm thiết kế từ trước, thì hai nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau nhờ enzyme nối T4-DNA ligase hoặc enzyme topoisomerase. Cấu trúc vector pCR®2.1TOPO được trình bày trong hình 2.2.
Vị trí để nối sản phẩm PCR vào được bố trí ở trong chuỗi gen lacZ, gen mã hóa và sản xuất enzyme β-galactosidase, có tác dụng xúc tác thủy phân một loại hóa chất có tên gọi là X-gal để tạo nên các dẫn chất có màu xanh. Vi khuẩn không mang plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên khuẩn lạc màu xanh. Khi sản phẩm được nối vào vị trí nối thành công, thì đoạn DNA ngoại lai làm bất hoạt gen lacZ không cho nó sản xuất ra enzyme β-galactosidase, và do vậy, vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ không có enzyme phân hủy cơ chất X-gal và khuẩn lạc sẽ mang màu trắng khi nuôi trên môi trường có chứa X-gal.
Thành phần phản ứng: Vector pCR2.1TOPO: 1 µl
Nước tinh khiết: 1 µl Sản phẩm PCR: 3 µl Dung dịch muối: 1 µl
Tổng số: 6 µl
- Giữ 10 phút. Chuyển nạp và nuôi cấy trên đĩa Petri chứa môi trường thạch LB có chứa kháng sinh và X-gal.
- Tế bào sử dụng để chuyển nạp là tế bào khả biến (competent cells) E. coli chủng DH5αT1 hoặc Top10 (Invitrogen). Khi được nuôi trong môi trường dinh dưỡng, plasmid trong tế bào chủ sẽ cùng nhân lên với hệ gen tế bào chủ và phân chia cùng tế bào chủ khi tế bào phân chia.
Sau khi nuôi cấy tiền hành chọn lọc khuẩn lạc và nuôi cấy trong môi trường lỏng. Khuẩn lạc màu trắng trên môi trường LB agar được lựa chọn để nuôi cấy trong các ống chứa môi trường LB lỏng. Chọn khuẩn lạc màu trắng ngà là tốt nhất.
- Bổ sung 10 µl kanamycin (50mg/ml) để chọn lọc dòng có mang gen kháng kháng sinh.
- Có thể bổ sung thêm 7 µl X-gal (40mg/ml) vào môi trường để kiểm tra thêm một lần nữa, ống môi trường có vi khuẩn tái tổ hợp phát triển sẽ không có màu xanh còn ống có vi khuẩn không tái tổ hợp sẽ có màu xanh.
- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trường được lắc ở 220 vòng/phút trong vòng từ 16 đến 20 giờ ở 370C.
(Môi trường LB lỏng tương tự như môi trường LB agar đặc nhưng không bổ sung agar).
- Plasmid tái tổ hơ ̣p sau khi đươ ̣c tách chiết thu DNA plasmid tái tổ hơ ̣p sẽ đươ ̣c cắt kiểm tra la ̣i bằng enzyme giớ i ha ̣n EcoRI. Thành phần phản ứng cắt enzyme đươ ̣c trình bày trong bảng 2.6 dưới đây
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI
Thành phần Thể tích
10X buffer for EcoRI (Fermentas) 2µl
EcoRI (Fermentas) 1µl
DNA plasmid (10U/µl) 1µl
Nước tinh khiết 16µl
Tổng 20µl
Các plasmid tái tổ hợp dương tính sẽ được gửi sang công ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự . Pasmid tái tổ hợp thu được khi lai đoa ̣n DNA vào vector pJET1.2 sẽ được giải trình tự bằng hai mồi trên vector là:
- Mồi xuôi: pJET1.2F:5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’ - Mồi ngược: pJET1.2R: 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’
Plasmid tái tổ hơ ̣p thu đươ ̣c khi lai đoa ̣n DNA vào vector pCR2.1TOPO sẽ được giải trình tự bằng hai mồi trên vector là:
- Mồi xuôi (M13F): 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ - Mồi ngược (M13R): 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’