Phân tích kết quả

3. Nội dung nghiên cứu

2.2.6. Phân tích kết quả

Việc xác định người tham gia đóng góp mẫu lẫn ở bất kỳ dữ liệu ADN lẫn nào đều phải dựa trên đánh giá của toàn bộ kiểu gen như: căn cứ vào chiều cao peak, tỷ lệ các alen, xem xét số người có khả năng đóng góp (điều này căn cứ vào tình tiết vụ việc: số nạn nhân, số đối tượng…) để xác định xem kiểu gen có phải là của một người hay nhiều người đóng góp hay cụ thể là tại mỗi locus gen là biểu hiện của duy nhất một người hay của nhiều người. Một hồ sơ ADN được xem là có hơn một người đóng góp nếu có từ ba hoặc nhiều hơn ba alen ở một hoặc nhiều locus và tỷ số chiều cao giữa một cặp đỉnh alen cho một hoặc nhiều locus thấp hơn giá trị ngưỡng. Ở đây ngưỡng thích hợp cho tỷ số chiều cao đỉnh alen, phòng thí nghiệm phải xác định trong quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOP). Giá trị của ngưỡng phụ thuộc vào huỳnh quang khi điện di sau khi khuếch đại ADN bằng cách PCR. Các giám định viên phân tích thông tin của từng đỉnh alen hiện diện trong từng locus nhất định. Thông tin này thể hiện dưới các đơn vị huỳnh quang tương đối (RFU). Việc thiết lập các ngưỡng dựa trên giá trị huỳnh quang là rất quan trọng đối với việc đánh giá chính xác dữ liệu nhập STR bởi vì nó chính thức hóa các tiêu chí tối thiểu mà một sản phẩm PCR phải hiển thị để đánh giá về định tính. Tối thiểu phải thiết lập một ngưỡng biên độ đỉnh (PAT). Nếu đỉnh tối thiểu trong RFU có độ tin cậy (PAT) quá thấp thì không chắc chắn đỉnh đã thể hiện trong bảng kiểu gen là một alen.

PAT được thiết lập để giải thích cho những hạn chế ngẫu nhiên được công nhận bởi kết quả điện di sau khi PCR và có hiệu quả thiết lập giá trị chiều cao đỉnh thấp nhất mà phòng thí nghiệm sẽ xử lý một phản ứng như là phát hiện ra một đoạn ADN chứ không phải là tạo ra do thiết bị. Điều này không có nghĩa là một PAT nhất định nhất thiết phải bằng giới hạn phát hiện (LOD) của hệ thống phân tích. Trong khi LOD là mức cực nhỏ tuyệt đối của chất phân tích có thể được kỳ vọng là sẽ dẫn đến một tín hiệu tích cực từ hệ thống phân tích, thì PAT có thể đại diện cho một giá trị ngưỡng lớn hơn LOD bởi một số giá trị nhất định (ví dụ, một vài đơn vị độ lệch tiêu chuẩn). Bất kỳ đỉnh nào ở ngưỡng này hay trên ngưỡng này thực sự là một amplicon PCR. PAT (50 RFU) được sử dụng trong hầu hết các phòng thí nghiệm pháp y của Mỹ nói chung và áp dụng làm tiêu chuẩn phòng thí nghiệm ở Việt Nam.

Thêm vào đó, một phòng thí nghiệm phải thiết lập một ngưỡng giải thích phù hợp (MIT). Ngưỡng này là cần thiết để tránh diễn giải khi sản phẩm PCR quá thấp, do bản sao của mẫu hạn chế hoặc do tác dụng của các các chất ức chế, có thể dẫn đến những kết quả không liên quan. MIT thiết lập chiều cao đỉnh tối thiểu trong RFU rằng tất cả các đỉnh alen tại một locus nhất định (hoặc locus) phải hiển thị để chắc chắn kết luận rằng không có thành phần di truyền nào của phần giải thích của một mẫu không thể phát hiện do sự khuếch đại PCR khác nhau của một đích.

Ở các vị trí mẫu có lượng dấu vết ít, mẫu bị ức chế PCR hoặc mẫu có chất lượng thấp thì khi nhân bội sẽ thu được lượng ADN thấp. Điển hình là các mẫu có chứa 200pg ADN hoặc ít hơn hoặc các mẫu không được tinh sạch hoặc có chất lượng thấp. Không phải tất cả các thành phần cấu tạo của ADN sẽ được tái tạo một cách đảm bảo khi có ảnh hưởng ngẫu nhiên đáng kể trong quá trình PCR, hiện tượng này sẽ ảnh hưởng đến vị

trí trong một cấu hình của kiểu gen và cần phải được giải thích có thể không đưa vào kết luận.

Để tối đa hóa tổng số các đỉnh alen đáp ứng hoặc vượt quá MIT cho một mẫu hỗn hợp lẫn nào đó, đỉnh alen ở mỗi locus nhất định không được vượt quá MIT. Bởi vì điều quan trọng là các ngưỡng này được đánh giá thực nghiệm và được thiết lập trong phòng thí nghiệm. PAT và MIT có thể được thực hiện hoạt động như một giá trị ngưỡng duy nhất hoặc là hai ngưỡng chiều cao điểm riêng biệt dựa trên dữ liệu thu được từ các nghiên cứu xác nhận nội bộ của phòng thí nghiệm (bao gồm các phân tích bản sao thấp).

Các locus FGA có xu hướng có kích thước khuếch đại lớn nhất khi sử dụng các bộ dụng cụ thương mại hiện tại. Ngoài ra, do nhiều alen FGA có tiềm năng lớn hơn ảnh hưởng của khuếch đại ưu đãi có thể xảy ra giữa các alen dị hợp tử. Do đó, có thể một alen FGA có kích thước lớn có thể rút ra khi alen nhỏ hơn dị hợp tử của nó được quan sát ngay cả khi không có ảnh hưởng rõ ràng của alen ở các locus khác có cùng chiều cao. Do đó, cần phải thận trọng khi giải thích, phòng thí nghiệm có thể phát triển một MIT hợp lệ thông qua các thí nghiệm.

Các mẫu có chất lượng dấu vết kém, hoặc mẫu bị ức chế trong quá trình PCR. Bản sao thấp ở đây đề cập đến bất kỳ mẫu nào có quá ít ADN. Điển hình là các mẫu có chứa 200 pg hoặc ít hơn 200 pg ADN hoặc mẫu có chất lượng xấu, không đảm bảo độ tinh khiết. Không phải tất cả các thành phần của mẫu ADN sẽ được nhân bội một cách tốt nhất trong quá trình PCR, và trong nhiều trường hợp không thể đưa ra kết luận.

Để tối đa hóa tổng số các đỉnh alen đáp ứng hoặc vượt quá MIT (ví dụ, khuyếch đại khối mẫu lớn hơn) cho một mẫu hỗn hợp nào đó, đỉnh cao của tất cả các đỉnh alen ở một locus nhất định không được vượt quá MIT. Bởi vì điều quan trọng là các ngưỡng này được đánh giá thực nghiệm và được thiết lập trong phòng thí nghiệm, PAT và MIT có thể được thực hiện hoạt động như

một giá trị ngưỡng duy nhất hoặc là hai ngưỡng chiều cao điểm riêng biệt dựa trên dữ liệu thu được từ các nghiên cứu xác nhận nội bộ của phòng thí nghiệm (bao gồm các phân tích bản sao thấp).

Hiện tại trong các phòng thí nghiệm ở Mỹ thì biên độ đỉnh (PAT) hay còn gọi là ngưỡng phân tích là 75 RFU, còn ngưỡng giải thích hay còn gọi là ngưỡng ngẫu nhiên là 125 RFU. Nếu đỉnh alen nào > 50 RFU thì xem như có ADN.

Các bước trong việc giải thích hỗn hợp mẫu lẫn

Bước 1: Xác định sự tồn tại của mẫu lẫn: Sau khi điện di, bảng kiểu gen sẽ thể hiện trong một locus có từ ba đỉnh trở lên có khả năng sẽ tồn tại hỗn hợp mẫu lẫn.

- Kiểm tra số đỉnh có mặt trong một locus. - Nhiều hơn 2 đỉnh ở một locus.

- Kiểm tra độ cao đỉnh tương đối. - Đỉnh dị hợp tử không cân bằng <60%. - Đỉnh ở vị trí stutter >15%.

- Xem xét tất cả các locus được khảo sát.

Bước 2: Xác định các đỉnh (peaks) của alen (xác định đỉnh thật hay đỉnh giả): Trong các peaks được label (dán nhãn) thì trong đó sẽ có những stutter.

- Sử dụng các quy tắc giải thích dữ liệu thông thường để giải thích giữa các alen thực và các đỉnh giả.

- Sử dụng bộ lọc stutter để loại bỏ các sản phẩm stutter từ các đỉnh đang xem xét (mặc dù stutter có thể che dấu một số alen thành phần nhỏ ở một vài locus).

- Xem xét các độ cao đỉnh dị hợp tử mất cân bằng lớn (<60%) là có khả năng đến từ hai người đóng góp khác nhau.

- Cách tính tỷ lệ chiều cao đỉnh áp dụng công thức:

PHR = Lower RFU (đỉnh thấp)/Higher RFU(đỉnh cao)(x100%) Nếu tỷ lệ PHR ≥ 60% thì hai đỉnh alen này là của cùng một người. Nếu tỷ lệ PHR < 60% thì hai đỉnh alen này là của hai người khác nhau. Bước 3: Xác định khả năng số người đóng góp cho mẫu lẫn: Cụ thể trong một hỗn hợp có lẫn của bao nhiêu người (thể hiện bằng số peak) đồng thời so sánh với mẫu đối chứng. Thông thường có 2, 3 hoặc 4 alen ở một locus thì có hai người đóng góp, có 5 đến 6 alen ở một locus thì có 3 người đóng góp. Lưu ý trường hợp có 4 người trở lên thì không kết luận chính xác.

Bước 4: Xem xét tất cả các tổ hợp kiểu gen (xác định kiểu gen của từng người trong mẫu lẫn, ví dụ của nạn nhân hay đối tượng của vụ án).

Bước 5: Ước tính tỷ lệ tương đối của người tham gia đóng góp vào hỗn hợp mẫu lẫn.

- Hỗn hợp đang nghiên cứu với các mẫu đã biết thể hiện tỉ lệ hỗn hợp giữa các locus được duy trì khá tốt trong suốt quá trình khuếch đại PCR.

- Như vậy các độ cao đỉnh của alen có trong một bảng kiểu gen có thể liên quan trở lại với nồng độ các thành phần ban đầu.

Tỉ lệ người đóng góp chính và người đóng góp phụ trong mẫu lẫn được tính theo công thức sau:

Người đóng góp chính =

Tổng RFU (người đóng góp chính)

Người đóng góp phụ =

Tổng RFU (người đóng góp phụ)

Tổng RFU (tất cả các đỉnh alen) X 100%) Bước 6: So sánh với các mẫu tham khảo.

Sơ đồ 2.1. Các bước trong việc giải thích hỗn hợp mẫu lẫn

Xác định sự tồn tại của mẫu lẫn

Xác định số lượng các đỉnh alen

Xác định số lượng người đóng góp vào mẫu lẫn

Xem xét tất cả các tổ hợp kiểu gen

Ước tính tỷ lệ tương đối của người tham gia đóng góp vào mẫu lẫn

So sánh với các mẫu tham khảo Bước 1: Bước 2: Bước 3: Bước 4: Bước 5: Bước 6:

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu

3.1.1 Thu thập mẫu lẫn từ các vụ án hình sự

Tiến hành thu thập mẫu lẫn từ 18 vụ án hình sự do Công an các địa phương gửi đến trưng cầu Viện khoa học hình sự từ tháng 8 năm 2016 đến tháng 4 năm 2017. Trong 18 vụ án thu thập được 26 dấu vết có khả năng để lại mẫu lẫn:

Bảng 3.1. Kết quả thu thập mẫu từ các vụ án hình sự

Stt Loại dấu vết Số lượng

1 Máu 14

2 Tinh trùng 04

3 Tế bào biểu bì da 02

4 Tế bào niêm mạc miệng 02

5 Lông, tóc 01

6 Mô, tổ chức cơ thể 03

Các mẫu nghi lẫn thu được trong quá trình giám định các vụ án hình sự do Cơ quan Công an địa phương trưng cầu bao gồm mẫu máu, tinh trùng, tế bào biểu bì da, tế bào niêm mạc, lông, tóc và mô, tổ chức cơ thể. Trong đó mẫu máu chiếm số lượng lớn với tỉ lệ 53.8% thường gặp ở các vụ đánh nhau gây thương tích có nhiều đối tượng tham gia, các vụ giết người, tai nạn giao thông có nhiều nạn nhân. Dấu vết máu nghi lẫn thu thập được nhiều trên các vật mang là các dụng cụ gây án như dao, rựa, gậy, quần áo… và các dấu vết máu thu trên nền nhà, nền đất, lá cây… tại hiện trường, ở các trường hợp này qua quá trình nghiên cứu hồ sơ vụ án thông qua nội dung Quyết định trưng cầu giám định xác định được vụ án có nhiều đối tượng bị thương tích và không xác định được vị trí dấu vết máu mà các đối tượng để lại trên mẫu vật, do vậy khả năng mẫu lẫn ở các trường hợp này xảy ra là tương đối cao. Tiếp đến là các vụ hiếp dâm có để lại dấu vết tinh trùng chiếm 15,38% xảy

ra ở các vụ việc có nhiều đối tượng tham gia hiếp dâm một nạn nhân hoặc dấu vết lẫn giữa tế bào âm đạo nạn nhân với đối tượng. Đối với dấu vết lông, tóc thì xác định mẫu lẫn ở các mẫu lông, tóc thu được tại hiện trường với số lượng từ 02 sợi trở lên. Đối với các vụ mẫu nghi lẫn là các tế bào biểu bì da xảy ra chủ yếu ở các vụ chết chưa rõ nguyên nhân, các vụ giết người mà nạn nhân và đối tượng có dấu hiệu cào cấu, trường hợp này thường thu mẫu móng tay. Các vụ tế bào niêm mạc miệng lẫn thường ở các vụ việc yêu cầu giám định tế bào để lại trên đầu vú nạn nhân trong các vụ hiếp dâm, giao cấu trái ý muốn hoặc trên các miệng chai, cốc uống nước, trên phong bì thư.

3.1.2. Tách chiết ADN mẫu nghi lẫn

Sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex và prepfiler để tách chiết đối với 26 dấu vết mẫu lẫn trên kết quả thu được như sau:

Sơ đồ 3.1: Kết quả tách chiết ADN bằng phương pháp pepfiler và chelex

Cách chia mẫu: Cắt mỗi mẫu nghi lẫn thành hai lượng tương đương nhau và chuyển vào hai ống Eppendorf để tiến hành tách chiết AND bằng phương pháp pepfiler và chelex , đối với 01 mẫu tóc thu tại hiện trường có số lượng 04 sợi cắt gốc tóc chuyển vào 02 ống, mỗi ống có 02 gốc tóc.

Các mẫu sau khi được tách chiết bằng hai phương pháp là chelex và prepfier kết quả thu được ADN từ phương pháp prefiler là tối ưu hơn, số lượng dấu vết mẫu lẫn có ADN sau khi tách bằng prepfiler nhiều hơn. Cụ thể trong 26 dấu vết mẫu lẫn nếu tách bằng phương pháp prepfiler có 22 mẫu tách được ADN chiếm 84,6%, 04 mẫu không tách được ADN chiếm 15,4%, nếu tách bằng phương pháp chelex có 17 mẫu tách được ADN, chiếm 65,4%, 09 mẫu không tách được ADN chiếm 34,6%. Nguyên nhân là các dấu vết thu lượm từ các vụ án xảy ra tại hiện trường và trên người tử thi nên dấu vết bám dính trên các vật mang khác nhau, có lẫn nhiều tạp chất, thời gian thu lượm cũng như tồn tại trong các điều kiện khác nhau dẫn đến dấu vết mẫu vật có thể bị hư hỏng, ADN bị biến tính, nếu tách bằng phương pháp chelex thường có độ tinh sạch không cao, sản phẩm ADN sau khi tách chiết còn lẫn nhiều tạp chất và các chất ức chế mà chelex không thể loại đi được. Sử dụng phương pháp tách chiết bằng prepfiler dựa trên ái lực của than hoạt tính đối với ADN sẽ giúp loại bỏ được các chất ức chế không cần thiết ra khỏi dung dịch, tối ưu hóa việc giữ lại ADN, đảm bảo thu được ADN tinh sạch với lượng ADN nhiều hơn so với phương pháp tách chiết bằng chelex.

Bảng 3.2. Kết quả tách chiết mẫu từ các vụ án hình sự

Stt Mẫu dấu vết, phương pháp Chelex Prepfiler Có ADN Không có ADN Có ADN Không có ADN 1 Máu 10 04 13 01 2 Tinh trùng 03 01 03 01 3 Tế bào biểu bì da 01 01 02 0 4 Tế bào niêm mạc miệng 01 01 01 01

5 Lông, tóc 01 0 01 0

Kết quả gần như phù hợp với tình trạng mẫu vật khi được gửi đến giám định. Trong 17 mẫu dấu vết máu có 03 mẫu dấu vết khi quan sát bằng mắt thường có mẫu trong tình trạng bị mốc, một phần có màu xanh hoặc ẩm ướt có mùi hôi thối, 01 mẫu dấu vết có màu nâu đỏ, khô nhưng sau khi thu tại hiện trường về đã được qua sử lý bằng nhiệt độ máy sấy. Như vậy trong điều kiện không được bảo quản tốt, hoặc không được phơi khô trong điều kiện tự nhiên mà có tác động của nhiệt độ cao các dấu vết máu thường bị phân hủy mạnh, do đó khi sử dụng phương pháp chelex để tách chiết dấu vết thu được ADN thường không cao. Đối với tinh trùng do đặc điểm cấu tạo phần đầu tinh trùng nên ADN được bảo vệ tốt hơn do vậy khi tách bằng hai phương pháp chelex và prepfiler thường cho hiệu quả như nhau. Đối với dấu vết tế bào biểu bì da thường thu được trong các mẫu móng tay của nạn nhân và đối tượng khi cào cấu, tế bào niêm mạc miệng thu được tại miệng cốc, chén uống nước và phong bì thư trường hợp này lượng dấu vết tế bào da để lại trong móng tay ít nên khi tách chiết bằng phương pháp