Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp điều tra tình hình phòng chống bệnh ký sinh trùng nói chung, bệnh sán lá gan và sán lá dạ cỏ nói riêng cho trâu chăn thả tại khu chung, bệnh sán lá gan và sán lá dạ cỏ nói riêng cho trâu chăn thả tại khu vực ven sông Hồng
- Bằng phương pháp quan sát và phỏng vấn trực tiếp chủ trại chăn nuôi.
3.5.2. Phương pháp lấy mẫu phân trâu
* Phương pháp lấy mẫu, thu thập mẫu phân
Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu phân tươi (30- 40g/mẫu) của trâu được lấy trực tiếp từ trực tràng hoặc lấy ngay sau khi trâu thải phân vào sáng sớm (từ 5 đến 7 giờ) trước khi cho trâu đi chăn thả. Các mẫu được lấy ngẫu nhiên theo các độ tuổi của trâu bao gồm: dưới 6 tháng tuổi; từ 6 - 18 tháng tuổi; từ 19 - 36 tháng tuổi; từ 37 - 120 tháng tuổi và trên 120 tháng tuổi. Mỗi độ tuổi sẽ được lấy từ 5 trâu đực và 5 trâu cái. Riêng nhóm trên 120 tháng tuổi chỉ có 5 trâu cái do không có trâu đực ở độ tuổi này. Mỗi mẫu sau khi lấy đều được để riêng vào một hộp chứa mẫu phân chuyên dụng hoặc túi nilon và ghi nhãn nhận biết riêng. Ngoài ra các thông tin về mẫu như loại gia súc (trâu), địa điểm, tuổi, tính biệt, trạng thái phân, thời gian lấy mẫu và các biểu hiện lâm sàng của trâu sẽ được ghi riêng vào phiếu thông tin mẫu để làm cơ sở cho việc xử lý kết quả phân tích mẫu. Các mẫu phân được bảo quản trong bình bảo ôn (2-80C) ngay sau khi lấy, trong quá trình vận chuyển và xét nghiệm ngay trong ngày.
3.5.3. Phương pháp theo dõi số liệu mổ khám
Những cá thể trâu trong đàn khi bị giết thịt đều được chúng tôi kiểm tra kỹ gan và dạ cỏ để tìm sán lá gan và sán lá dạ cỏ để bổ sung thêm thông tin cho các nội dung nghiên cứu liên quan tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm trứng trong phân cũng như hiệu quả tẩy trừ của thuốc.
3.5.4. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan và sán lá dạ cỏ trâu cỏ trâu
+ Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán:
Thực hiện xét nghiệm phân tìm trứng sán lá gan và sán lá dạ cỏ bằng phương pháp gạn rửa sa lắng Benedek (1943).
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng nước lã sạch tách trứng giun sán ra khỏi phân. Trứng giun sán có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của nước lã sẽ chìm xuống, có thể thu nhận để quan sát chẩn đoán dưới kính hiển vi.
Phương pháp gạn rửa sa lắng có thể phát hiện khá tốt trứng sán lá gan, trứng sán lá dạ cỏ, trứng sán lá ruột lợn, đốt sán dây. Nếu để lắng cặn 30 - 60 phút có thể phát hiện trứng giun đũa và một số trứng giun tròn khác.
Chú ý, khi xét nghiệm phân cần phân biệt trứng giun sán với cặn thức ăn, bào tử nang của nấm, trứng của các loài tiết túc có thể có trong phân, cũng như phải phân biệt đặc điểm hình thái của từng loại trứng. Trứng giun sán thường có 2 hoặc 4 lớp vỏ, nhẵn hoặc lồi lõm, trong trứng có phôi bào hoặc ấu trùng.
Cách tiến hành:
Lấy 5 g phân cho vào cốc thủy tinh. Dùng đũa thủy tinh dầm nát rồi cho nước lã vào. Lấy đũa thủy tinh khuấy đều, đánh phân, mục đích là làm cho trứng tách khỏi phân. Dùng lưới lọc đặt trên miệng bình tam giác (có thể tích (V = 600 ml)), rồi đổ dung dịch phân vừa đánh được trong cốc thủy tinh qua lưới lọc. Thêm nước lã vào bình tam giác cho đủ thể tích (đến vạch 500 ml). Để yên cho lắng cặn khoảng 15 - 30 phút.
Đổ nhanh tay phần nước phía trên đi, ngừng lại đột ngột để giữ phân lắng cặn phía dưới bình. Cho thêm nước lã vào đến vạch 500 ml, để yên cho lắng 15 phút, rồi đổ phần nước phía trên. Quá trình đổ nước đi, thêm nước vào và chờ thời gian lắn cặn được lặp đi lặp lại 3 - 5 lần (số lần này tùy theo mẫu phân).
Khi mẫu lắng cặn đã trong suốt thì đổ lớp nước trong phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới bình. Đổ căn vào đĩa petri, kiểm tra bằng kính hiển vi soi nổi.
+ Phương pháp xác định cường độ nhiễm sán:
Sử dụng Phương pháp đếm trứng Mc. Master.
Phương pháp này dùng để xác định số lượng trứng sán trong 1 g phân bằng buồng đếm Mc. Master. Cân 4 gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan phân. Lọc qua lưới thép vào
một cốc khác và khuấy đều. Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút hút dung dịch phân nhỏ đầy cả hai buồng đếm Mc. Master (mỗi buồng đếm có dung tích 0,5 ml). Để yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 10).
Trong thực tế, để dễ phát hiện và dễ đếm trứng, có thể cải tiến như sau: + Bước l: cân 4 gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm nước lã sạch (khoảng 100 - 150 ml), khuấy tan phân, lọc bỏ cặn bã thô. Nước lọc để lắng trong 1 - 2 giờ, gạn bỏ nước, giữ lại cặn.
+ Bước 2: cho 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan cặn. Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút hút 1 ml dung dịch phân nhỏ đầy 2 buồng đếm Mc. Master. Để yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 10).
Đếm toàn bộ số trứng trong những ô của hai buồng đếm, rồi tính theo công thức sau:
Cách xác định cường độ nhiễm sán lá gan và sán lá dạ cỏ ở trâu: - Không tìm thấy trứng: Không bị nhiễm.
- Từ 1 đến 100 trứng/1g phân: Cường độ nhiễm nhẹ (+).
- Từ 100 - 200 trứng/1g phân: Cường độ nhiễm trung bình (++). - Trên 200 trứng/1g phân: Cường độ nhiễm nặng (+++).
Cách phân biệt trứng Fasciola sp. với trứng Paramphistomum cervi:
Đặc điểm
hình thái Trứng Fasciolasp. Trứng Paramphistomumcervi
Màu sắc Màu vàng nâu Màu tro nhạt
Hình dạng Hình bầu dục, phình rộng ở giữa và hai đầu thon nhỏ gần đều nhau
Hình trứng, phình rộng ở giữa, thon về hai đầu không đều nhau, đầu nhỏ có nắp trứng
Tế bào noãn Hoàng
To đều và xếp kín trong vỏ trứng, ranh giới giữa các phôi bào rõ ràng
Phôi bào trong trứng xếp không đều nhau, có khi dồn lại thành đám lớn
Kích thước 0,13-0,16 × 0,06-0,10 mm 0,13-0,15 × 0,16-0,08 mm
Tổng số trứng ở 2 buồng đếm x 60 Số trứng/1g phân =
* Xác định hiệu quả tẩy trừ sán lá gan và sán lá dạ cỏ ở trâu của Han- Dertil B và Dovenix
Các cá thể trâu bị nhiễm sán lá gan và sán lá dạ cỏ được chia thành 2 nhóm đảm bảo tương đối đồng đều theo độ tuổi, tính biệt và cường độ nhiễm trứng sán sau đó được điều trị bằng hai loại thuốc là Han-Dertil B (13 con) cho theo đường uống 1 viên/50kg TT và Dovenix (13 con) cho theo đường tiêm dưới da 1ml/25kg TT. Hiệu lực tẩy của các thuốc được xác định dựa vào tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm trứng sán trong 1 gam phân ở các thời điểm tuàn thứ 3 và tuần thứ 6 sau khi sử dụng thuốc.
Nếu không thấy trứng sán trong phân thì xác định thuốc có tác dụng triệt đối với sán lá gan và sán lá dạ cỏ, nếu vẫn thấy trứng sán trong phân nhưng số lượng đốt sán giảm đi rõ rệt thì xác định thuốc có hiệu lực tẩy sán nhưng chưa triệt để, nếu thấy số lượng trứng sán trong phân không giảm so với trước khi dùng thì xác định thuốc không có hiệu lực đối với sán lá gan và sán lá dạ cỏ.
Theo dõi số chỉ tiêu sinh lý trước và sau tẩy để xác định độ an toàn của thuốc (Hồ Văn Nam, 1982). Các chỉ tiêu theo dõi gồm:
- Thân nhiệt: Dùng nhiệt kế đo ở trực tràng trên 5 phút.
- Tần số mạch đập: Là số lần mạch đập trong 1 phút, bắt mạch ở động mạch đuôi.
- Tần số hô hấp: Là số lần thở ra hít vào trong 1 phút, để tay ở trước mũi con vật để có cảm giác hít vào và thở ra.
- Nhu động dạ cỏ: Dùng tay ấn vào hõm hông bên trái đếm số lần nhu động dạ cỏ (lần/2 phút).