Toàn bộ DNA tổng số được thu nhận bao gồm DNA của nhân tế bào chủ và DNA của hệ gen virus bằng cách sử dụng bộ kit tách chiết DNA tổng số theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).
- Phá vỡ màng tế bào, màng nhân. - Loại bỏ protein.
- Tủa DNA.
Sau công đoạn tách chiết, DNA tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Ly tâm cho phép thu nhận DNA dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa tan lại trong nước theo nồng độ mong muốn.
Cách tiến hành
Tách chiết DNA tổng số theo hướng dẫn của Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit. Các bước cụ thể được thể hiện ở bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.2. Quy trình tách chiết DNA tổng số
Bước Tiến hành
1 Bổ sung 150 µl H2O vào ống eppendorf chứa tăm bông có mẫu bệnh phẩm, vortex nhiều lần, ủ 37oC qua đêm.
2 Bỏ tăm bông (vắt kiệt nước nhất có thể), bổ sung 180 µl Digest solution và 20 µl Protease K, vortex.
3 Ủ 56oC, vortex liên tục 10 phút/lần cho đến khi dung dịch đồng nhất 4 Bổ sung 20 µl enzyme RNase A, vortex, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. 5 Bổ sung 200 µl Lysis solution, vortex cho đến khi dung dịch đồng nhất. 6 Bổ sung 400 µl Ethanol 50%, vortex.
7 Chuyển dịch lên cột lọc, li tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng.
8 Bổ sung 500 µl WB1, li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phı́a dưới ống hứng.
9 Bổ sung 500 µl WB2, li tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng.
10 Li tâm làm khô ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng.
11 Chuyển cột lọc sang ống thu, bổ sung 45 µl EL, để nhiệt độ phòng 2 phút, li tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút.