Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng.
Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan tâm bằng mồi đặc hiệu với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase trong một chu trình nhiệt hợp lí. Mồi tác động trên mạch DNA 5’ – 3’ còn được gọi là mồi xuôi (Forward primer), thường kí hiệu là F. Mồi tác động trên mạch DNA 3’ – 5’ còn được gọi là mồi ngược (Reverse primer), thường kí hiệu là R. Khi các mồi kết hợp với sợi DNA bổ sung của nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại theo phản ứng dây chuyền với enzyme polymerase.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm ba giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Biến tính. 94oC trong 5 phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổng hợp.
- Giai đoạn 2: Gắn mồi. 50 – 65oC trong 1 – 2 phút (tùy thuộc vào đoạn mồi). Giai đoạn này để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA khuôn.
- Giai đoạn 3: Tổng hợp. 68 – 72oC trong 30 giây – 2 phút. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại
Quá trình này thực hiện từ 30 – 40 chu kì. Sau chu kì cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72oC trong 5 – 10 phút để các sợi đơn DNA đóng xoắn lại thành mạch đôi.
Kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên thạch agarose 0,8 – 1% và băng DNA sẽ được nhìn thấy rõ dưới tia cực tím sau khi được nhuộm Ethidium Bromide.
Cách tiến hành
Cặp mồi sử du ̣ng trong nghiên cứu được thiết kế dựa trên so sánh trı̀nh tự tương đồng chuỗi nucleotide của tất cả các chủng CPV-2 hiện có trên Ngân hàng gen theo nghiên cứu của Đoàn Thị Thanh Hương và cs., 2018.
Trình tự của că ̣p mồi như sau:
Mồi xuôi CPVF2b: 5’-TTGGCGTTACTCACAAAGACG- 3’ (vi ̣ trı́ 2160 – 2179 của hê ̣ gen).
Mồi ngược CPVR4: 5’-GCATTTACATGAAGTCTTGG -3’ (vi ̣ trı́ 5023 – 5042 của hê ̣ gen).
Că ̣p mồi trên đươ ̣c sử du ̣ng để khuếch đa ̣i vùng gen có kı́ch thước 2,9 kb chứa toàn bô ̣ gen VP2 gồm 1755 nucleotide.
Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3:
Bảng 3.3. Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần Thể tích(µl)
DreamTaqTM PCR Master Mix (2X) 25
DMSO 2
Mồi xuôi (10 pmol/ µl) 2
Mồi ngược (10 pmol/ µl) 2
Khuôn DNA 3
H2O 16
Tổng thể tích 50
Bảng 3.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoa ̣n Nhiệt độ(oC) Thời gian Số chu kì
Giãn xoắn 94 5 phút 1 Biến tính 94 30 giây 35 Gắn mồi 48 30 giây Kéo dài 72 3 phút Kết thúc 72 10 phút 1 Bảo quản sản phẩm +4 ∞