Demodex sp được cho vào ống đựng mẫu và để trong liquid nitrogen
trong 1 phút, làm đông tan 4 lần trong 10 phút. DNA được chiết tách sử dụng kit chiết tách DNA Omega, Georgia, USA. Mẫu thu được bảo quản ở -20oC cho đến khi dùng.
2.3.2. Mồi sử dụng trong nghiên cứu
Các mồi (sense: 5'-GACCCGGATTATTATGAGT-3', antisense: 5'- TTAGCTTAATCTTACACTAA-3') được thiết kế theo trình tự gen của gen D.
canis ở GenBank (No.AB080667) (Ya-e ZHAO – 2012).
2.3.3. Cách tiến hành phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật rất đa năng và ứng dụng hết sức rộng rãi. Một phản ứng PCR gồm có 6 thành phần tham gia [5]:
1) ADN làm khuôn
3) Enzyme ADN-polymerase chịu nhiệt (hiện nay được dùng phổ biến nhất là Taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus)
4) Môi trường đệm cung cấp ion Magie (Mg++)
5) Phần nucleotit ở dạng deoxynucleotit (ký hiệu dNTP) 6) Nước tinh khiết
Có ba giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho một chu kỳ:
1) Được thực hiện ở nhiệt độ 940C trong 5 phút, các phân tử ADN xoắn kép sẽ bị tách ra, tạo nên các sợi đơn dùng làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzym ADN-polymerase xúc tác tổng hợp.
2) Thực hiện phản ứng lai (annealing): Nhiệt độ được hạ xuống 500C trong 1 phút, để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử ADN khuôn.
3) Giai đoạn tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài) (extension): Nhiệt độ được nâng lên 720C trong 2 phút và kéo dài ở 720C trong vòng 10 phút, để các sợi ADN vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép, chính là sản phẩm PCR.
Sản phẩm PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép ADN được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose nồng độ 2%. Và được kiểm tra bằng ánh sáng tia UV sử dụng thước đo 100 bp DNA ladder (TAKARA, Japan).
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Phòng khám và chăm sóc thú cưng GAIA số 38 đường 1 khu F361 An Dương, Tây Hồ, Hà Nội.
- Bộ môn Ký sinh trùng – Khoa Thú y.
- Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Từ tháng 09/2016 đến tháng 08/2017
3.3 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tượng nghiên cúu 3.3.1. Đối tượng nghiên cúu
- Chó có triệu chứng bệnh ngoài da thuộc các giống chó nuôi tại Hà Nội ở mọi lứa tuổi khác nhau được đưa đến khám, điều trị tại phòng khám và chăm sóc thú cưng GAIA.
- Demodexsp thu thập tại địa điểm nghiên cứu.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
+ Dụng cụ nghiên cứu: Dao cạo, lam kính, lam men, dầu soi kính, kính hiển vi, gang tay, cân, máy ảnh, máy PCR
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh do Demodex trên chó tại địa bàn Hà Nội Hà Nội
- Xác định tỷ lệ mặc bệnh ngoài da trên chó nuôi ở địa bàn Hà Nội. - Xác định thành phần loài Demodex gây bệnh trên chó nuôi ở Hà Nội. - Xác định tỷ lệ chó mắc bệnh do Demodex sp. theo lứa tuổi.
- Xác định tỷ lệ chó mắc bệnh do Demodex sp. theo nguồn ngốc chó (nội, ngoại).
- Xác định tỷ lệ chó mắc bệnh do Demodex sp. theo tính biệt. - Xác định tỷ lệ truyền lây bệnh Demodicosis từ mẹ sang con - Xác định tỷ lệ chó mắc bệnh do Demodex sp. theo kiểu lông. - Xác định tỷ lệ chó mắc bệnh do Demodex sp. theo mùa vụ.
- Xác định tỷ lệ vị trí vùng da nhiễm Demodex sp. trên cơ thể chó nuôi nhiễm bệnh.
3.4.2. Mô tả đặc điểm bệnh lý, lâm sàng của bệnh do Demodex sp. trên chó
Xác định một số đặc điểm bệnh lý và triệu chứng lâm sàng do Demodex sp.
gây ra.
3.4.3. Định loại loài Demodex sp
Xác định thành phần loài Demodex sp. gây ra cho chó trong nghiên cứu.
3.4.4. Đề xuất biện pháp phòng trị 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp theo dõi và thu thập thông tin
Trong số những chó nuôi trên địa bàn Hà Nội đem đến khám, điều trị và sử dụng các dịch vụ của GAIA (chăm sóc sắc đep, cắt móng cắt, nhuộm lông,…). Chúng tôi theo dõi và ghi chép đầy đủ các thông tin cần nghiên cứu vào sổ khám bệnh bao gồm mã hiệu, giống chó, nguồn gốc, tính biệt, độ tuổi, thời gian thăm khám và địa điểm nuôi của các chó mắc bệnh ngoài da. Toàn bộ số liệu được cập nhật vào phần mền quản lý của phòng khám.
3.5.2. Phương pháp kiểm tra và lấy mẫu trên da
Quan sát các triệu chứng lâm sàng của chó nghi nhiễm Demodex sp. thường biểu hiện như ngứa, tổn thương ngoài da, rụng lông, thường xuất hiện quanh mắt, tứ chi hay toàn bộ cơ thể, viêm da sâu có dịch rỉ, có mủ, mùi hôi tanh, đóng vảy. Dùng dao cạo da ở vùng tiếp giáp giữa da lành và da bệnh cho đến khi rớm máu. Mẫu da cạo được phết đều lên phiến kính, sau đó soi mẫu dưới kính hiển vi (X10) tìm Demodex sp. Mẫu da, lông chó nghi mắc bệnh mò bao lông do
Demodex sp. thu trực tiếp tại phòng khám. Chẩn đoán căn bệnh dựa trên hình
thái Demodex sp. theo mô tả của Phan Lục và Phạm Văn Khuê (1996).
3.5.3. Phương pháp quan sát, đánh giá vùng da tổn thương
Xác định bệnh tích thông qua tổn thương ở da bằng phương pháp đánh giá vùng da tổn thương theo phương pháp của Gortel, 2006. Cụ thể, với mức độ tổn thương trên 50% bề mặt da của cơ thể được xếp vào thể bệnh toàn thân (generalized demodicosis). Những ca bệnh chỉ có những dấu hiệu rụng lông, ban đỏ, da đóng vảy chủ yếu ở vùng mặt và chân với mức độ tồn thương dưới 50% bề mặt da của cơ thể được coi là thể bệnh cục bộ (localized Demodicosis). Trong nghiên cứu này, để phân tích sự phân bố của Demodex sp. trên cơ thể chó nuôi
chúng tôi phân chia vùng da nhiễm Demodex sp. theo 3 vùng chính: đầu và chân trước, lưng và bụng, mông và chân sau.
3.5.4. Phương pháp phân loại loài Demodex sp
a) Phương pháp phân loại dựa theo hình thái
Được tiến hành theo mô tả của Izdebska (2010). Loài thân dài, mảnh là loài D. injai và loài thân ngắn là loài D. cornei. Như vậy Demodex có ba loài gây bệnh trên chó và căn cứ vào đặc điểm hình thái, cấu tạo, chúng tôi đã phân định loài đó là D. canis thân dài, dày; D. injai thân dài, mảnh; D. cornei thân ngắn.
Demodex canis Demodex injai Demodex cornei
Hình 3.1: Hình thái của ba loài Demodex
b) Phương pháp định loại bằng sinh học phân tử
Phân tích mẫu bằng phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu.
3.5.5. Phương pháp phân loại giống chó nội và chó ngoại
Chúng tôi tiến hành phân loại các ca bệnh dựa trên nguồn gốc chó nuôi thành 2 nhóm chó nội và ngoại. Chó nội hay chó ta, chó mực, chó vện là các giống chó thuần chủng tồn tại từ lâu đời và gắn bó với đời sống người Việt từ nông thôn đến thành thị như chó Bắc Hà, chó Lài (Dingo Đông Dương), H’mông cộc đuôi và đặc biệt là chó Phú Quốc,… Chó ngoại là những giống chó có nguồn gốc ngoại nhập từ Nhật Bản, Trung Quốc, Đức,... như giống chó Fox, Chihuahua, Akita, Bulldog, Dobermann,… Còn các giống chó lai (là những giống chó lai giữa cho nội và chó ngoại và thường đẻ tại Việt Nam) và chúng tôi tạm ghép vào giống chó nội.
3.5.6. Phương pháp phân loại nhóm lông dài và ngắn ở chó
Dựa vào đặc điểm dài, ngắn của lông, chúng tôi cũng tiến hành phân thành 2 nhóm chó lông ngắn và lông dài. Chó lông ngắn là những giống chó có độ dài
của lông phủ ngắn hơn 2cm và lông thường mượt và áp sát vào da như giống Fox, Dobermann, Phú Quốc,... Chó lông dài là những giống chó có độ dài của lông phủ dài hơn 2cm thường xù, quăn và phải chăm sóc tắm chải thường xuyên chẳng hạn như Poodle, Pomeranian, Akita, Alaska, ...
3.5.7. Phương pháp đánh giá mức độ gây bệnh của Demodex canis trên chó qua biểu hiện lâm sàng qua biểu hiện lâm sàng
Bệnh thể hiện ở nhiều mức độ từ thể nhẹ đến nặng.
+ Thể nhẹ: Chó có biểu hiện rụng lông một vài điểm trên da ở vùng mặt, chân hoặc lưng và bụng, chó không ngứa hoặc ít ngứa, nhiều trường hợp da tăng sinh, dày cộm, nhăn nheo và có vảy.
+ Thể nặng: Chó rụng lông ½ hoặc toàn thân, da dày cộm lên, có nhiều mảng vảy bong tróc ra, chó rất ngứa gãi liên tục. Một số con chó da đỏ ửng, lở loét và có dịch rỉ viêm chảy ra, có nhiều mụn mủ thường do vi khuẩn thứ phát, chó lờ đờ, bỏ ăn, mệt mỏi,…
3.5.8. Mùa vụ trong năm
Dựa vào đặc điểm khí hậu hiện tại ở Hà Nội, chúng tôi chia 1 năm thành các mùa như sau:
+ Mùa Xuân: Từ tháng 3 đến hết tháng 5. + Mùa Hạ: Từ tháng 6 đến hết tháng 8. + Mùa Thu: Từ tháng 9 đến hết tháng 11. + Mùa Đông: Từ tháng 12 đến hết tháng 2.
3.5.9. Quy định lứa tuổi chó
Dựa vào các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của chó, chúng tôi phân ra 3 lứa tuổi như sau:
+ Dưới 1 tuổi: là lúc chó còn non, đang trong giai đoạn phát triển thể vóc, hoàn thiện về sinh lý, sinh dục.
+ Từ 1 đến 3 tuổi: là giai đoạn sinh sản, chó được cho phối và sinh đẻ. + Trên 3 tuổi: là giai đoạn chó bắt đầu có dấu hiệu lão hóa và già đi.
3.5.10. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mềm Êxcel., Minitab để xử lý thống kê. Sự sai khác chỉ có ý nghĩa khi P<0,05.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM DEMODICOSIS TRÊN CHÓ TẠI ĐỊA BÀN HÀ NỘI ĐỊA BÀN HÀ NỘI
4.1.1. Tỷ lệ mặc bệnh ngoài da trên chó nuôi ở địa bàn Hà Nội
Trong thời gian điều tra, nghiên cứu và điều trị bệnh tại phòng khám, chúng tôi phát hiện một số bệnh ngoài da trên chó đến khám và kết quả được thể hiện ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ mặc bệnh ngoài da trên chó nuôi ở địa bàn Hà Nội
Pa,b,c,d<0,05
Bệnh Số con mắc bệnh Tỷ lệ (%)
Nấm da 27 31,4a Mò bao lông (Demodicosis) 38 44,2b Ghẻ ngầm (Sarcoptosis) 8 9,3c Viêm da dị ứng 13 15,1d Tổng 86 100
Qua Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1. chúng tôi nhận thấy, trong thời gian theo dõi từ tháng 09/2016 đến tháng 08/2017 có tổng công 86 chó nuôi có các biểu hiện ngứa, mụn đỏ, da đóng vảy và viêm da đến thăm khám và điều trị tại phòng khám thú y GAIA, bằng khám lâm sàng và kiểm tra qua kính hiển vi chúng tôi thấy nguyên nhân do nấm da là 27 ca chiếm 31,4%; do Demodex sp.
có 38 ca chiếm tỷ lệ cao nhất 44,2%, ghẻ do Sarcotes sp. là 8 ca chiếm tỷ lệ thấp nhất 9,3%.
Theo nghiên cứu của Chen (2012) và nghiên cứu của Dongjie (2014), tỷ lệ nhiễm lần lượt là 13,31% và 25,0% thấp hơn với kết quả của chúng tôi. Nguyên nhân bệnh do Demodex sp. cao có thể do các giống chó nhập ngoại thích nghi kém với điều kiện khí hậu ở Việt Nam, làm giảm sức khỏe cũng như sức để kháng. Phong trào nuôi chó phát triển mạnh, chó được mua đi bán lại, đồng nghĩa với thay đổi môi trường nuôi, thay đổi chủ,… nên chó dễ bị stress, kéo theo sức đề kháng giảm dẫn đến Demodex có cơ hội phát triển và gây bệnh. Khí hậu miền
Bắc nóng ẩm là môi trường thuận lợi cho nấm ở da phát triển sau đó kế phát
Demodex sp. nên tỷ lệ bệnh nấm da và Demodicosis cao.
Tỷ lệ chó bị viêm da dị ứng chiếm 15,1% nguyên nhân có thể do muỗi, bọ chét, ve rận đốt, dị ứng với các loại dầu tắm, nước hoa hoặc ăn thức ăn không phù hợp.
4.1.2. Kết quả chó mắc Demodicosis theo các lứa tuổi
Bảng 4.2. Kết quả chó mắc Demodicosis theo các lứa tuổi
Pa,b,c<0,05 Tuổi Số con mắc Tỷ lệ(%) Dưới 1 22 57,9a 1-3 12 31,6b Trên 3 4 10,5c Tổng số 38 100
Qua Bảng 4.2 chúng tôi thấy, trong tổng số 38 ca bệnh Demodicosis thì độ tuổi chó dưới 1 tuổi bị nhiễm Demodex sp. là cao nhất với 22 ca bệnh chiếm 57,9%. Chó nuôi trong giai đoạn từ 1 đến 3 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm 31,6%, với chó nuôi trên 3 năm tuổi thì tỷ lệ nhiễm là thấp nhất với 10,5% .
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với những đánh giá của Nayak (1997) khi điều tra cho thấy tỷ lệ chó dưới 1 năm tuổi nhiễm Demodex canis là cao nhất chiếm 60,0%. Chó ở các độ tuổi khác nhau thì tỷ lệ nhiễm bệnh khác nhau. Tỷ lệ nhiễm cao tập trung ở độ tuổi dưới 1 năm tuổi, nguyên nhân có thể do đây là giai đoạn mà chó nuôi dễ bị ảnh hưởng bởi các tác nhân gây stress (tiêm vaccine, thay răng, thay đổi chủ,...) làm giảm sức đề kháng của cơ thể, dẫn đến khả năng nhiễm
Demodex sp. tăng cao. Tiếp theo là giai đoạn từ 1-3 tuổi là giai đoạn sinh sản,
chó nuôi có thể bị ảnh hưởng do các lần phối giống, mang thai,… nên tỷ lệ nhiễm cũng tương đối cao. Như vậy, yếu tố lứa tuổi có ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm
Demodicosis ở chó nuôi.
4.1.3. Kết quả chó mắc Demodicosis theo tính biệt
Theo một số nghiên cứu gần đây, tỷ lệ nhiễm Demodex canis ở chó đực cao hơn so với chó cái (Dong, 2009), tuy nhiên so với nghiên cứu đánh giá của Nayak(1997), thì tỷ lệ nhiễm Demodex canis ở chó cái lại cao hơn. Kết quả của chúng tôi được trình bày ở Bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả chó mắc Demodicosis theo tính biệt Pa,b>0,05 Tính biệt Số con mắc Tỷ lệ(%) Đực 18 47.4a Cái 20 52.6b Tổng số 38 100
Kết quả cho thấy trong tổng số 38 ca bệnh Demodicosis thì tỷ lệ nhiễm
Demodex sp. ở chó đực là 47.4%, ở chó cái là 52.6%. Nguyên nhân tỷ lệ nhiễm
bệnh ở chó cái cao hơn có thể do ở lứa tuổi 1-3, là độ tuổi sinh sản dẫn đến chó cái dễ bị stress hơn, giảm sức đề kháng, dễ mắc bệnh hơn.
Tuy nhiên theo nghiên cứu của Tsai (2011) thì tỷ lệ nhiễm Demodex canis ở con đực chiếm tỷ lệ cao trội hơn so với con cái và cũng theo nghiên cứu của Begum (2011) ở chó đực (66,6%) cao hơn so với chó cái (57,1%). Nguyên nhân này được tác giả Miu (1974) cho rằng có sự liên quan đến quá trình tiết dịch của tuyến bã nhờn của da, ảnh hưởng bởi hormone sinh dục đực và hormone tuyến thượng thận của chó đực.
4.1.4. Tỷ lệ truyền lây Demodicosis từ mẹ sang con
Trong tổng số 20 chó cái nhiễm Demodex, có 12 chó cho sinh sản, chó con sinh ra nhiễm bệnh được thống kê dưới bảng sau:
Bảng 4.4. Tỉ lệ chó con sinh ra nhiễm Demodex sp
STT Nội dung Số lượng Tỉ lệ
1 Số chó mẹ có con sinh ra không mắc bệnh 8 0.67
2 Số chó mẹ có con sinh ra mắc bệnh 4 0.33
Tổng 12 1
Dựa vào Bảng 4.4. ta nhận thấy số chó mẹ có con sinh ra không mắc bệnh chiếm tỷ lệ cao, những trường hợp này đều là đã chữa khỏi Demodicosis sau đó mới cho sinh sản, do đó con không bị lây bệnh từ mẹ. Những chó con sinh ra bị lây từ mẹ là trong trường hợp chó mẹ chưa điều trị dứt điểm bệnh, vậy
cứu của Gortel (2006). Demodicosis không phải là một bệnh di truyền, nhưng hệ thống miễn dịch bị ức chế khiến chó con có thể dễ bị nhiễm trùng. Tất cả các con chó con đều nhận Demodex sp. từ mẹ, nhưng chỉ một số ít có hệ thống miễn dịch kém hiệu quả mới phát triển thành bệnh. Sự nhạy cảm này có thể được di truyền qua các thế hệ. Thông qua việc nhân giống cẩn thận, hầu hết các trường hợp mắc
Demodicosis đều có thể được loại bỏ (Demodex mange in dogs – Pet Education).
4.1.5. Kết quả chó mắc bệnh Demodicosis theo nguồn gốc (nội, ngoại)
Chúng tôi phân chia giống chó thành 2 nhóm dựa vào nguồn gốc (chó nội,