Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký

 Sắc ký lớp mỏng: Chuẩn bị:

-Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1100

C trong 30 phút.

-Dung môi pha đúng theo tỷ lệ , đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1 cm), để bão hòa trong 30 phút.

-Dùng mao quản chấm dịch chiết DMHC hoặc các phân đoạn quá trình sắc ký cột lên bản mỏng , cách mép dưới 1,5 cm, cách 2 mép bên 1 cm. Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, lặp lại 3-5 lần.

Khai triển sắc ký : Đặt bản mỏng vào bình sắc ký , khi dung môi chạy đến ¾ bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.

Hiện sắc đồ : Sấy khô bản mỏng , sau đó soi đèn UV hoặc hiện hình bằng vi sinh vật

-Soi đèn UV : Bản mỏng sắc ký tráng sẵ n đã trộn với một chất phát huỳnh quang khi chiếu ánh sáng UV (thường sử dụng bản mỏng silica gel 60 GF254 hãng Merck). Nên vết chất sẽ tương ứng với vết huỳnh quang sẫm màu.

-Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng , đổ thạch có cấy VSV kiểm định phủ lên, để ở tủ 370

C trong 18-24h. Vết kháng sinh được xác định dựa vào vòng vô khuẩn.

Tính Rf: Rf =

dm v

d d

dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết.

ddm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đường dung môi chạy.  Sắc ký cột:

Chuẩn bị:

-Mẫu thử: Bột KS thô thu được sau cất quay dịch chiết DMHC. -Dung môi: pha đúng theo tỷ lệ.

-Cột: đường kính 1 cm, dài 50 cm, rửa sạch, tráng cồn, sấy khô.

-Chất nhồi cột: Silica gel 60 F254 Merck cỡ hạt 0,06-0,1mm. Cân khoảng 6-8 g hạt, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Hòa thành hỗn dịch với hệ dung môi hữu cơ chạy cho đến khi hết bọt khí rồi đưa lên cột.

-Đưa mẫu thử lên cột : Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, sau đó trộn với khoảng 1-2 g silicagel đã hoạt hóa . Sấy ở 500

C cho bay hết methanol thì cho lên cột đã ổn định cột trong 30 phút.

Chạy cột: Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch (đã tráng cồn để khô), mỗi phân đoạn 5-10 ml.

Xác định phân đoạn chính chứa kháng sinh cần tách:

Thử hoạt tính KS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc . Các phân đoạn có hoạt tính KS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Phân đoạn chính là các phân đoạn có những vết có Rftương đương và có hoạt tính kháng sinh mạnh.