Việt Nam
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh của một số giống lúa Việt Nam
Tái sinh mẫu hạt giống là giai đoạn quan trọng để quyết định việc tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho quá trình chuyển gen tiếp theo. Nếu như bước tái sinh mẫu hạt giống không thành công thì các quy trình chuyển gen về sau thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens cũng không thể tiến hành. Để tiến hành tái sinh mẫu trước hết cần phải khử trùng mẫu hạt cho phù hợp với từng loại đối tượng cũng như từng loại mẫu khác nhau. Nguồn mẫu hạt giống lúa đưa vào nuôi cấy trong các thí nghiệm được thu thập từ ngoài tự nhiên nên chứa rất nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy, cần lựa chọn nồng độ, thời gian chất khử trùng thích hợp để đưa vào môi trường nuôi cấy.
3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam.
Hạt lúa chín sau khi đã thu thập ở ngoài tự nhiên, hạt giống được bóc vỏ cẩn thận bằng tay để tránh tổn thương phôi. Khử trùng mẫu trong box cấy bằng viên khử trùng EFFERVESCENT nồng độ 5g/200ml mước cất trong 20 phút, sau đó xử lý bằng EtOH 70% trong 1-2 phút, rửa lại qua 2-3 lần nước cất, thấm khô hạt bằng giấy thấm trong vòng 20-30 phút. Mẫu hạt sau khi thấm khô được cấy vào các đĩa petri có chứa sẵn 25 ml môi trường trên mỗi đĩa, đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng nuôi cấy 25 ± 2OC.
Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường N6 bổ sung: đường glucose 30g/l + 1 mg/l 2,4D + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8.
Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: số mẫu cấy, số mẫu tạo callus, tỷ lệ mẫu tạo callus được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần.
Công thức 1: Giống lúa JO2
Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5
Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai
3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam.
Sau khi mẫu đã tạo callus, ta sử dụng nhóm các chất cytokinins để kích thích sự tái sinh tạo chồi. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường N6 bổ sung: bổ sung 1 mg/l BAP + đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8.
Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: số mẫu cấy, số mẫu tạo chồi, tỷ lệ mẫu tạo chồi được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần.
Các công thức bao gồm:
Công thức 1: Giống lúa JO2
Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5
Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai
3.3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam.
Sau khi mẫu đã tạo chồi, ta sử dụng nhóm các chất để kích thích sự tái sinh tạo chồi. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường N6 bổ sung: 1 mg/l BAP + 1 mg/l NAA đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8.
Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: số mẫu cấy, số mẫu không đạt, tỷ lệ mẫu tạo chồi được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần.
Các công thức bao gồm:
Công thức 1: Giống lúa JO2
Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5
Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai
3.3.1.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu khả năng ra rễ của một số giống lúa Việt Nam.
Sau khi mẫu đã nhân nhanh, ta sử dụng nhóm các chất để kích thích sự tái sinh tạo rễ. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường N6 bổ sung: 1ml/l Kinetin + đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8. Bổ sung nồng độ các chất
Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi số mẫu cấy, số mẫu không đạt, tỷ lệ ra rễ được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần.
Các công thức bao gồm:
Công thức 1: Giống lúa JO2
Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5
Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai
3.3.1.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh một số giống lúa Việt Nam.
Sau khi mẫu đã tạo rễ, ta sử dụng nhóm các chất để kích thích để tạo cây hoàn chỉnh. Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin
là thành phần của môi trường N6 bổ sung: đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8.
Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi số mẫu cấy, số mẫu không đạt, tỷ lệ tạo cây hoàn chỉnh được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần.
Các công thức bao gồm:
Công thức 1: Giống lúa JO2
Công thức 2: Giống lúa Bắc thơm 07 Công thức 3: Giống lúa LP5
Công thức 4: Giống lúa Khang dân Công thức 5: Giống lúa Bao thai
3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa Việt Nam Nam
Các mẫu giống lúa Việt Nam được tiếp nhận gen thông qua quá trình chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens. Xác định được khả năng tiếp nhận gen được tiến hành như sau: callus tốt nhất của thí nghiệm 1 trên môi trường N6 được ngâm trong dung dịch AAM có chứa vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 trong 3 phút. Sau đó, mẫu lúa được chuyển lên môi trường N6-AS nuôi cấy 4 ngày. Sau đó, các mẫu này được chuyển sang môi trường chọn lọc N6-GA có chứa Glyfonate - ammonium
5mg/l và theo dõi trong 14 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức, 3 lần nhắc lại, 150 mẫu cho mỗi lần nhắc lại.
Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 5 công thức. Các chỉ tiêu theo dõi tỷ lệ % GUS+, tỷ lệ % GUS- được theo dõi và ghi chép 5 ngày/ lần. Các công thức được bố trí như sau:
Công thức 1: JO2
Công thức 2: Bắc thơm 07 Công thức 3: LP5
Công thức 4: Khang dân Công thức 5: Bao thai.
Quy trình chung được tóm tắt như sau tực hiện như sau: Hạt giống nuôi cấy trong môi trường 2N6 - Tối
4 tuần
Chuyển sang môi trường 2N6 - Tối 4 - 10 ngày
Nuôi cấy hai loại tế bào vào 2N6-AS - Tối 3- 7 ngày
Nuôi chọn lọc trong môi trường 2N6 - Tối 4tuần, 2N6- TCH (2 tuần)
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen lúa thông qua qúa trình tiếp nhận gen
bằng vi khuẩn A. tumefaciens [30]
3.4 Các phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu của các thí nghiệm được thu thập hàng tuần. Số liệu tinh được phân tích sự sai khác theo phương pháp so sánh cặp đôi 1 One-way ANOVA with posthoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) trên phần mềm Microsoft Excel. Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau:
Chuy ể n m ô t ố t l ê n m ôi t r ư ờ ng 2N 6- T CH - T ố i t 2 u ầ n Chuy ể n và o m ôi t r ư ờ ng RG H 6 - T ố i ngà 7 y Chuy ể n s a ng nuôi s á ng 4 - 6 ngà y Chuy ể n c â y c on s a ng m ôi t r ư ờ ng ½ M S H – S á ng Chuy ể n c â y c on và o nhà kí nh đ ể t he o dõi kh ả n ă ng t i ế p nh ậ n ge n
Tỷ lệ mẫu sống (%) =
Tỷ lệ mẫu chết (%) =
Tổng số mẫu sống (mẫu)
100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Tổng mẫu thu được (mẫu)
100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
Hệ số nhân chồi =
Tổng chồi thu được
100% Tổng chồi nuôi cấy
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam.
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo callus, như tác giả Phan Thị Thu Hiền, sử dụng môi trường MS + 1 mg/l 2,4D thu được tỷ lệ tạo callus cao nhất là 78,7% [5]. Tác giả
Phan Thị Hương, với tỷ lệ tạo callus của JO2 là 81% trên môi trường N6 + 2 mg/l 2,4-D + 100 mg/l L-proline + 300 mg/l casein hydrolysate, Ozawa (2008) [8].
Tuy nhiên trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh được hiệu quả của N6 + 1 mg/l 2,4D + 30 g/l đường glucose + 6 g/l agar, pH = 5,6 - 5,8 cho hiệu quả cao nhất lên đến 94,2%, thí nghiệm chứng tỏ khả năng hình thành callus phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất lượng giống với nhau, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu về sau. Kết quả nghiên cứu được trình bày, thể hiện rõ ràng và chi tiết trong bảng 4.1, hình 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của một số giống lúa Việt Nam.
Giống Số mẫu Thời gian Mẫu chết Mẫu tạo Tỷ lệ tạo callus trung bình tạo callus trung bình callus trung bình
(hạt) trung bình (hạt) trung bình (%) (ngày) (hạt) JO2 150 5,33 8,7 141,3a 94,2 Bắc thơm 07 150 7,33 61,7 88,3b 58,87 LP5 150 28,67 130,3 19,7e 13,13 Khang dân 150 13,67 111,7 38,3d 25,53 Bao thai 150 10,67 98,3 51,7c 34,47 CV% 9,56 4,17 4,92 LSD.05 2,14 0,64 0,64
(a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,05)
Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.1 cho thấy: Với giá trị LSD0.5 = 0,64 và CV% = 4,92 thì các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý ngĩa và ở mức độ tin cậy 95%. Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 4.1) cho thấy khả năng hình thành callus bị ảnh
hưởng bởi giống (bản chất di truyền). Kết quả phân tích biến sai của yếu tố giống cho thấy rằng khi F = 593,51 lớn hơn rất nhiều lần Fcrit = 3,48 chứng tỏ sự sai khác về tỷ lệ tạo callus bị ảnh hưởng mạnh bởi yếu tố bộ giống, chứng tỏ bản chất di truyền có bị ảnh hưởng đến việc tạo callus của từng giống lúa, các giống lúa có khả năng tạo callus cao từ 50% đến 95% (JO2 94,2%, Bắc thơm 07 58,87%, Bao thai 34,47%, Khang dân 25,53%, LP5 13,13%) là bản chất và có ý nghĩa thống kê.
A
B
D
C
Hình 4.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo callus của giống lúa JO2
(A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo callus tốt giảm dần)
4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam Từ kết qủa nghiên cứu khả năng tạo callus có kết luận ban đầutiến hành đánh giá khả năng tạo chồi của một số giống lúa Việt Nam, các công thức thí nghiệm cho kết quả tạo callus thành công được chuyển sang môi trường tạo chồi N6 + 1 mg/l BAP + 30 g/l đường glucose + 6g/l agar, pH = 5,6–5,8.
Bộ giống có khả năng tạo chồi trên môi trường nghiên cứu so sánh khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo J02 có khả năng tái sinh số cây tái sinh/cụm mô sẹo 16,33%, trên môi trườngtái sinh N6 bổ sung 3 mg/l BAP + 1 mg/l -NAA, Phan Thị Hương và cộng sự (2014)[8].
Việc chuyển các mẫu tốt sang môi trường có BAP cho kết quả được trình bày, thể hiện rõ ràng và chi tiết trong bảng 4.2 và hình 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa
Việt Nam
Giống Số mẫu Thời gian Mẫu chết Mẫu tạo Tỷ lệ tạo chồi trung bình tạo chồi trung bình chồi trung bình
(hạt) trung bình (hạt) trung bình (%) (ngày) (hạt) JO2 150 5,17 6 144a 96 Bắc thơm 07 150 5,27 28 122b 81,33 LP5 150 11,8 61,7 88,3e 58,87 Khang dân 150 7,87 47,7 102,3d 68,2 Bao thai 150 7,07 36,7 113,3c 75,33 LSD.05 7,09 8,52 2,69 CV% 0,96 0,70 0,55
(a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,05)
Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.2 cho thấy: Với giá trị LSD0.5 = 0,55 và CV% = 2,69 thì các công thức thí nghiệm có ý ngĩa và ở mức độ tin cậy cao là 95%. Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 4.2) cho thấy khả năng hình thành tạo chồi bị ảnh hưởng bởi giống (bản chất di truyền). Kết quả phân tích biến sai của yếu tố giống cho thấy F = 125,13 lớn hơn rất nhiều lần Fcrit = 3,48 chứng tỏ một lần nữa sự sai khác về tỷ lệ tạo chồi bị ảnh hưởng bởi yếu tố bộ giống, chứng tỏ bản chất di truyền có bị ảnh hưởng ít nhiều đến việc tạo chồi của từng giống lúa, các giống lúa có khả năng tạo chồi cao từ 50% đến 96% (JO2 96%, Bắc thơm 07 81,33%, Bao thai 75,33%, Khang dân 68,2%, LP5 58,87%) là bản chất và có ý nghĩa thống kê.
Để đánh giá chất lượng chồi, dữ liệu thực nghiệm về thời gian phát triển chồi và hình thành callus trong nuôi cấy in vitro một số giống lúa Việt Nam đã chỉ ra rằng cả thời gian tạo callus và hình thành chồi đạt giá trị vào ngày chuyển mẫu sang môi trường tạo chồi. Nó có nghĩa là sự hình thành chồi tiến triển gần như song song với sự phát triển của callus.
A
B
D
C
Hình 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tạo chồi của một số giống lúa JO2
(A,B,C,D,E là chất lượng mẫu theo thứ tự tạo chồi tốt giảm dần)
4.3 Kết quả nghiên khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam.
Ngoài ra, một số giống lúa Việt Nam đều có khả năng tái sinh để nhân nhanh, phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu đáp ứng các tiêu chí của mục đính là hoàn thiện các quy trình nghiên cứu in vitro trên các giống lúa có khả năng tái sinh cao phục vụ cho công tác chuyển gen. Nguồn mẫu tạo chồi tiếp tục được chuyển sang môi trường N6 bổ sung: 1 mg/l BAP + 1 mg/l NAA đường glucose 30g/l + agar 6g/l, pH= 5,6 – 5,8 để nhân với số lượng cao, đánh giá chất lượng bộ giống cao hơn, giảm thời gian quy trình vào mẫu nhiều lần, rút ngắn thời gian, giảm rủi ro mà vẫn có số lượng mẫu lớn phục vụ cho công tác nghiên cứu lâu dài. Kết quả của thí nghiệm dược ghi nhận, trình bày rõ ràng và chi tiết trong bảng kết qủa thí nghiệm 4.3 và hình 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả nghiên khả năng nhân nhanh của một số giống lúa Việt Nam.
Giống Số mẫu Thời gian Mẫu chết Mẫu nhân Hệ số nhân chồi trung bình nhân chồi trung bình nhanh chồi trung bình
(hạt) trung bình (hạt) trung bình (lần) (ngày) (hạt)
JO2 150 5,57 4 296a 1,97 Bắc thơm 07 150 7,83 24,3 275,7b 1,7 LP5 150 15,57 120,3 179,7e 1,2 Khang dân 150 10,63 95 205d 1,37 Bao thai 150 9,17 67,7 232,3c 1,55 LSD.05 7,37 7,32 1,92 CV% 1,27 0,91 0,77
(a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,05)
Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.3 cho thấy: Với giá trị LSD0.5 = 0,77 và CV% = 1,92 thì các công thức thí nghiệm có ý ngĩa và ở mức độ tin cậy cao là 95%. Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 4.3) cho thấy khả năng hình thành số lượng lớn chồi bị ảnh hưởng bởi giống (bản chất di truyền). Kết quả phân tích biến sai của yếu tố giống cho thấy rằng F = 335,56 lớn hơn rất nhiều lần Fcrit = 3,48 chứng tỏ một lần nữa sự sai khác về tỷ lệ tạo chồi nhân nhanh bị ảnh hưởng bởi yếu tố bộ giống, chứng tỏ bản chất di truyền có bị ảnh hưởng ít nhiều đến việc tạo chồi của từng giống lúa, có giống lúa có hệ số tạo chồi nhân nhanh cao từ 0,12 đến (JO2 1,97, Bắc thơm 07 1,7, Bao