4. Tính mới của đề tài
2.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm để nghiên cứu nội dung của đề tài
Theo một số kết quả nghiên cứu đã công bố [1], [5], [7] về thời gian phát triển sinh khối của tế bào của các chủng thuộc Bacillus sp. và nhiệt độ thủy phân bởi các chế phẩm enzyme của các chủng này, thời gian 16 giờ là thời gian tối ưu để Bacillus
sp. phát triển tế bào, 24 giờ là thời gian tốt nhất để Bacillus sp. sinh enzyme ngoại bào, 50oC là nhiệt độ thích hợp để các enzyme thủy phân BĐN. Chúng tôi kế thừa những kết quả trên để tiến hành bố trí các thí nghiệm trong nghiên cứu.
Các thí nghiệm nghiên cứu xử lý BĐN được thực hiện theo hai bước.
Bước đầu tiên, thí nghiệm được bố trí xử lý riêng rẽ BĐN bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2. Trong quá trình nghiên cứu xử lý này, mật độ gieo cấy ban đầu, thời gian ủ được thay đổi. Hoạt độ amylase, protease, hàm lượng nitơ formol, đường khử và giá trị pH được xác định sau khi lên men giữa các mẫu thí nghiệm được so sánh để chọn các thông số công nghệ thích hợp.
Bước thứ hai, chúng tôi tiến hành phối trộn các bán thành phẩm BĐN đã được xử lý bởi hai loại vi sinh vật trên với sự thay đổi tỷ lệ. Tỷ lệ giữa BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2 là 2:1, 1:1, 1:2 và 0:1. Hỗn hợp này được đóng gói (200 g/gói) và tiến hành bảo quản ở nhiệt độ thường và tiến hành lấy mẫu để theo dõi sự biến đổi của các chỉ tiêu theo các mốc thời gian 0 ngày, 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày, 11 ngày, 13 ngày và 15 ngày bảo quản. Mỗi ngày lấy 3 gói để thực hiện thí nghiệm 3 lần lặp lại. Như vậy, có tất cả 8 mốc thời gian, 4 công thức phối trộn nên có tất cả 8 * 4 = 32 thí nghiệm. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần nên có tất cả 32 * 3 = 96 mẫu thí nghiệm (gói 200 g).
Mẫu đối chứng là mẫu không phối trộn với chế phẩm vi sinh. Sơ đồ thí nghiệm được thể hiện ở Sơ đồ 1.1, Phụ lục 1.
2.3.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình thủy phân bã đậu nành của chủng Bacillus amyloliquefaciens N1.
Quá trình bố trí thí nghiệm để xây dựng quy trình thủy phân bã nành của chủng
B. amyloliquefaciens N1 được thể hiện trên sơ đồ 1.2, Phụ lục 1. Theo đó, sinh khối của chủng B. amyloliquefaciens N1 được nuôi cấy trong BĐN ở 37oC trong 24 giờ với mật độ ban đầu thay đổi ở các mức 105CFU/g, 106 CFU/g, 107CFU/g và 108 CFU/g.
Sau khi xác định được mật độ gieo cấy ban đầu thích hợp, chúng tôi cố định mật độ gieo cấy ban đầu và tiếp tục thay đổi thời gian ủ ở các mức (16 giờ, 20 giờ, 24 giờ và 28 giờ) ở nhiệt độ 37oC. Trong giai đoạn này, chúng tôi xác định mật độ gieo cấy ban đầu và thời gian ủ thích hợp để vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme ngoại bào (protease và amylase) cao nhất. Việc xác định nhiệt độ thủy phân, sau đó, được thực hiện bằng cách tiếp tục ủ hỗn hợp trên ở các nhiệt độ khác nhau (40o
C, 45oC và 50oC) trong 4 giờ. Dựa vào hàm lượng nitơ formol, đường khử để chọn nhiệt độ thủy phân phù hợp nhất.
2.3.2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men bã đậu nành bởi Lactobacillus fermentum DC4t2
Quá trình bố trí thí nghiệm để xây dựng quy trình lên men BĐN bởi L. fermentum DC4t2 được thể hiện trên sơ đồ 1.3, Phụ lục 1. Theo đó, sinh khối của L. fermentum DC4t2 được nuôi cấy trong BĐN ở 43oC trong 24 giờ với mật độ ban đầu thay đổi (104 CFU/g, 105 CFU/g, 106 CFU/g, 107 CFU/g). Sau đó tiếp tục ủ hỗn hợp trên ở 43oC với mật độ giao cấy ban đầu thích hợp trong thời gian khác nhau (18 giờ, 20 giờ, 22 giờ và 24 giờ). Mật độ gieo cấy ban đầu và thời gian lên men thích hợp được xác định dựa vào mật độ sống của tế bào sau khi lên men.
2.3.2.3. Nghiên cứu xác định tỷ lệ phối trộn của bã đậu nành đã được xử lý riêng rẽ bởi Bacillus amyloliquefaciens N1 và Lactobacillus fermentum DC4t2 ảnh hưởng đến một số chỉ tiêu trong thời gian bảo quản
BĐN sau khi được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2 được phối trộn với các tỷ lệ 1:1, 2:1, 0:1 và đóng gói, mỗi gói 200 g. Các chỉ tiêu được theo dõi trong quá trình bảo quản là hoạt độ protease, amylase, hàm lượng nitơ formol và đường khử, pH, acid tổng số, hàm lượng NH3. Mẫu đối chứng là BĐN không qua xử lý.