- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
2,Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt cặp vào sợi khuôn:
Người ta có thể dùng các đoạn ADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho
trình tự ADN của vectơ gần sát với sợi khuôn hay primer đặc hiệu của
sợi khuôn mà nó sẽ bắt cặp vào. Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ở
chỗ mọi điều kiện đã được lựa chọn cho sợi khuôn và mồi được dùng lặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợi khuôn khác nhau. Hạn chế của loại
mồi này ở chỗ chỉ đọc được một đoạn ngắn của gene (300 – 500 bps)
trong trường hợp phải đọc các gene có kích thước lớn cần phải tiến hành subclone để đọc tiếp. Điều này có thể thực hiện bằng cách tạo ra các đoạn ADN ngẫu nhiên từ toàn bộ gene sau đó lại gắn vào vectơ để đọc cho hết trình tự của gene.
Phương pháp tiếp theo là sử dụng mồi được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với trình tự của gene. Theo cách này, lần lượt các đoạn được đọc mà không cần thao tác subclone. Tuy nhiên theo cách đoạn
mồi được thiết kế để đọc gene như vậy thì điều kiện cho từng phản ứng giải trình tự ADN với các mồi khác nhau sẽ không được tối ưu. Tuy
vậy, hiện nay việc tổng hợp mồi đã trở nên dễ dàng và phổ biến với
giá thành thấp, hơn thế nữa với sự trợ giúp của tin học thì bước thiết
kế mồi đã được tối ưu hoá. Vì vậy phương pháp này ngày càng trở lên thông dụng hơn. Sau khi mồi đã được thiết kế thì việc tiếp theo là chọn cách đánh dấu vào mồi hay vào đoạn ADN sẽ được tổng hợp. Ưu thế
có cùng một cường độ tín hiệu. Thông thường với phương pháp đọc
trình tự thủ công thì P32 thường được dùng. Ưu thế của nó là mang gốc photphat cao năng bêta mạnh, do đó chỉ cần trong thời gian ngắn là
thu được tín hiệu. Hạn chế của phương pháp này là do mang năng lượng cao nên khó phân biệt giữa các băng khác nhau so với dùng S35. Hiện nay để giải quyết vấn đề này người ta dùng P33 tuy giá thành cao
nhưng cho kết quả tốt hơn.
3, Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN:
Enzym thông dụng thường dùng là sequenase (là một dạng của
T7 DNA polymerase), enzym này có ưu thế hơn hẳn so với Klenow được dùng trước đây. Phản ứng được thực hiện nhanh hơn và thu được
kết quả tối ưu nếu có mặt ion Mn++, ion này giúp cho quá trình sao
chép có độ chính xác cao. Trước đây dNTPs đánh dấu với P32 được dùng để đánh dấu sản phẩm. Tuy nhiên ngày nay nhiều người đã chuyển sang dùng S35 thay thế cho P32, kết quả là cho độ phân giải cao hơn.
Mới đây phương pháp giải trình tự dựa trên kỹ thuật PCR được
gọi là chu kỳ giải trình tự trực tiếp ADN đang thay thế phương pháp cũ
dùng enzym sequenase. Về nguyên tắc thì các phương pháp này là
giống nhau. Ưu thế của phương pháp này là: lượng ADN đòi hỏi ít và không yêu cầu phải có mức độ tinh sạch cao. Ngoài ra, có một ưu điểm
nữa là phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao, do đó đã khắc phục được
những hạn chế của các phương pháp khác khi giải trình tự đối với các
sợi khuôn có cấu trúc bậc 2 (Fan & cộng sự, tạp chí Biotechniques 21:
1132-1137).