Các chỉ tiêu thẩm định

Các chỉ tiêu thẩm định phương pháp được thực hiện theo hướng dẫn của FDA và EMA [13], [26].

1.4.2.1. Tính chọn lọc – đặc hiệu

Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Nói cách khác, tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể nhận diện “chất cần phân tích” và không bị “nhầm lẫn” bởi các chất khác. Do vậy, kết quả phải được thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha trong mẫu trắng, chất cần phân tích phân tách hoàn toàn với các pic tạp. Tính chọn lọc – đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên SKĐ cho các đáp ứng pic thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau [13], [26]:

 Pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách được hoàn toàn khỏi pic tạp và đáp ứng các yêu cầu: Hệ số kéo đuôi (AS) ≤ 2,0; độ phân giải (RS) giữa pic của chất phân tích, pic IS với pic gần nhất phải lớn hơn

 Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng.

 Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng.

1.4.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học. Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất). Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học. Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích. Không nên xác định nồng độ mẫu thử dựa trên điểm ngoại suy của khoảng tuyến tính. Đường chuẩn sẽ không bao giờ có điểm “0” [13], [26].

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy. Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số r2 ≥ 0,99 và phải đáp ứng các điều kiện sau [13], [26]:

 Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85 – 115 %, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80 – 120 %.

 Có ít nhất 75 % số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn.

 Có hệ số tương quan r ≥ 0,99.

1.4.2.3. Giới hạn định lượng dưới

Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy, độ đúng và độ chính xác của phương pháp. LLOQ được chấp nhận với điều kiện đáp ứng của chất phân tích tại nồng độ này so với đáp ứng

của mẫu trắng ít nhất bằng 5 lần (tỷ số S/N ≥ 5), và có thể xác định với độ chính xác trong khoảng ± 20 % và độ đúng từ 80 – 120 % [13], [26].

1.4.2.4. Độ đúng và độ chính xác

Độ đúng và độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng độ của mẫu cần kiểm tra, 1 nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của phương pháp định lượng, 1 nồng độ gần với điểm giới hạn trên của đường chuẩn và 1 nồng độ ở gần điểm giữa. Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu độc lập.

Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu thử đồng nhất. Độ chính xác có thể được biểu thị bằng hệ số biến thiên (CV) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong ngày và giữa các ngày. Nói chung, CV ≤ 15 %, riêng nồng độ gần với LLOQ thì CV ≤ 20 %.

Độ đúng của phương pháp phân tích được biểu thị là khả năng tiến tới gần nồng độ thực nhất của chất phân tích trong mẫu sinh học. Điều đó có thể được biểu thị bằng khả năng tìm lại tương đối, và phải nằm trong khoảng 85 – 115 %, nhưng có thể chấp nhận 80 - 120 % đối với điểm gần LLOQ [13], [26].

1.4.2.5. Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo quy trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách được pha trong dung môi phù hợp (thường sử dụng dung môi pha động). Tỷ lệ thu hồi là hiệu suất chiết của phương pháp phân tích trong một giới hạn nhất định. Để khảo sát tỷ lệ thu hồi của phương pháp nên tiến hành tại 3 nồng độ thấp, trung bình và cao của đường chuẩn, mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 3 lần. Tỷ lệ thu hồi không nên vượt quá 110 % và không nên quá thấp; giá trị CV < 15 % đối vớ mỗi nồng độ và tỷ lệ thu hồi trung bình tại mỗi nồng độ không khác nhau quá ± 15 % [13], [26].

1.4.2.6. Độ ổn định

Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong lúc xử lý, phân tích và bảo quản mẫu. Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời

nên tiến hành tại 2 nồng độ thấp và cao của đường chuẩn, mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 3 lần. Do đó, trong thẩm định phương pháp cần xác định các loại độ ổn định. Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm [13], [26]:

a. Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông.

b. Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi đã xử lý (chiết tách).

c. Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thời gian dự định.

d. Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong hệ thống bơm mẫu tự động).

e. Độ ổn định của mẫu thử được đánh giá trên các mẫu tự tạo, bảo quản ở điều kiện lạnh (thường ở -2 °C đến -8 °C).

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu

Các hoạt chất OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương

2.1.2.Hóa chất, dung môi

Dung môi: acetonitril, methanol, nước (Merck, Đức) đạt chuẩn cho sắc ký lỏng. Hóa chất: kali dihydrophosphat, kali hydroxyd, triethylamin, natri acetat, acid acetic (Merck, Đức) đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.

2.1.3.Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu

Các chất đối chiếu được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành Phố Hồ Chí Minh, huyết tương người cung cấp bởi Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh (số kiểm soát: 1620 16L19) được trình bày ở Bảng 2.1.

Bảng 2.1.Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Hợp chất Số lô Hàm lượng Nơi cung cấp

Chuẩn OPZ QT134 130915 99,72 % Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM LPZ QT161 050413 98,53 % PPZ Natri QT219 030715 94,21 % RPZ Natri QT226 010813 96,29 % Chuẩn nội Indomethacin

(IDM) QT077 030710

98,51 %

2.1.4.Dụng cụ, máy móc, thiết bị

Dụng cụ: Các loại pipet, micropipet, bình định mức, các loại dụng cụ lấy mẫu: bơm tiêm, ống ly tâm, ống đựng huyết tương.

Thiết bị nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.2, tất cả các thiết bị được hiệu chuẩn định kỳ theo quy định. Các loại dụng cụ thủy tinh chính xác sử dụng hãng Vitlab – Đức đạt chuẩn chính xác cấp A.

Bảng 2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Đầu dò dãy diod quang (1260 diod) Agilent, Mỹ Cột sắc ký XDB Zobrax

(C18, 150 x 4,6 mm, 5 µm) Agilent, Mỹ

Máy đo pH S220K Mettler Toledo, Thụy Sĩ

Cân phân tích 0,01 mg, max 120 g Mettler Toledo, Thụy Sĩ

Bể siêu âm gia nhiệt Power Sonic, Taiwan

Máy quang phổ UV 1800 Shimadzu, Nhật

Máy ly tâm Hermle Z306K Hermle Z336K, Đức

Máy lắc vortex S200 Labnet, Mỹ

Hệ thống lọc dung môi Rooker 400, Taiwan

Màng lọc PTFE 0,22 µm; 0,45 µm Sartorius, Đức

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1.Các dung dịch thử nghiệm 2.2.1.Các dung dịch thử nghiệm 2.2.1.1. Dung dịch chuẩn gốc

Dung dịch nội chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn nội Indomethacin (IDM) cho vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 5 ml methanol (MeOH), siêu âm 5 phút. Thêm MeOH đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được có nồng độ IDM khoảng 500 µg/ml. Từ dung dịch này pha loãng đến nồng độ phù hợp khi thực hiện khảo sát.

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn PPIs cho vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 5 ml MeOH, siêu âm 5 phút. Thêm MeOH đến vạch, lắc đều (bình 1). Dung dịch thu được có nồng độ hỗn hợp OPZ, LPZ, PPZ và RPZ khoảng 1000 µg/ml.

2.2.1.2. Dung dịch chuẩn làm việc

Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với MeOH để được 2 dung dịch chuẩn làm việc (SW) có nồng độ hỗn hợp các PPIs trong SW1 là 144 g/ml và SW2 là 18 g/ml.

2.2.1.3. Mẫu đối chiếu

Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 trong 400 l huyết tương để thu được các mẫu đối chiếu có nồng độ hỗn hợp các PPIs là 2000 ng/ml và IS là 8000 ng/ml sau khi xử lý mẫu.

2.2.1.4. Mẫu kiểm tra

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc khác (chuẩn gốc thứ 2), pha loãng đến nồng độ phù hợp. Thêm lượng nhất định dung dịch này vào 400 l huyết tương để thu được các mẫu nồng độ thấp (LQC), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC) có nồng độ sau khi xử lý mẫu tương ứng là 1000 ng/ml, 3000 ng/ml và 5000 ng/ml.

2.2.1.5. Mẫu thử giả lập

Lấy 400 µl huyết tương trắng cho vào ống ly tâm. Thêm 50 µl dung dịch SW hỗn hợp PPIs (hoặc QC), vortex trong 30 giây. Thêm 50 µl dung dịch chất nội chuẩn, vortex trong 1 phút thu được mẫu giả lập.

2.2.2.Nội dung nghiên cứu

Qui trình nghiên cứu được thực hiện qua các giai đoạn như Hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu

2.2.2.1. Xây dựng điều kiện sắc ký

Nghiên cứu xây dựng điều kiện sắc ký được thực hiện trên máy HPLC Agilent Xây dựng điều kiện sắc ký

Phương pháp xử lý mẫu

Thẩm định quy trình phân tích đã chọn

các chất nghiên cứu, sử dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo, đề tài thực hiện khảo sát các điều kiện sắc ký trên cột sắc ký C18 150 x 4,6 mm; 5 µm với cột bảo vệ cùng loại:

Bước sóng phát hiện: Áp dụng bước sóng được khảo sát từ các dung dịch chuẩn OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH được các dung dịch OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có nồng độ khoảng 5 µg/ml. Tiến hành quét phổ hấp thu UV trên máy quang phổ UV 1800 (Shimadzu) của 4 dung dịch, chọn bước sóng phát hiện phù hợp.

Pha động: Thăm dò một số pha động, sử dụng hỗn hợp pha động là MeOH, ACN, phối hợp với dung dịch có pH thay đổi (dung dịch đệm hoặc dung dịch kiềm) ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân đối của pic đạt yêu cầu.

Tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu: được khảo sát đồng thời. Chọn điều kiện sắc ký sao cho pic PPIs và IDM tách hoàn toàn nhau và tách khỏi các pic tạp và đạt độ tinh khiết cần thiết cho định lượng và các thông số sắc ký đạt yêu cầu. Lựa chọn điều kiện sắc ký sao cho [26]:

 Hệ số phân giải giữa các chất không nhỏ hơn 1,5.  Số đĩa lý thuyết của các pic không nhỏ hơn 3000.  Hệ số bất đối xứng của các pic từ 0,9 đến 1,5.  Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 20 phút.

 RSD % của thời gian lưu của các pic với 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %.

 RSD% của tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/nội chuẩn của 6 lần tiêm lặp lại ở nồng độ định lượng không lớn hơn 2,0 %.

2.2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu

Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết tách sau đây:

Phương pháp gây tủa protein bằng dung môi hữu cơ: Từ mẫu thử giả lập, thêm tiếp 50 µl dung dịch KOH 0,25 M và 1,2 ml dung dịch MeOH hoặc ACN, vortex trong 5 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy dịch nổi, lọc qua màng PTFE 0,22 µm. Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký. Tiến hành song song với mẫu được chiết không kiềm hóa.

Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng: Từ mẫu thử giả lập, thêm tiếp 4,5 ml hỗn hợp dung môi diethyl ether - triethylamin (99 : 1), vortex trong 5 phút. Đem ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phút. Lấy 3 ml dịch nổi, bốc hơi ở 40 C bằng máy ủ nhiệt khô, cắn thu được đem hòa tan vào 1 ml dung dịch pha động, lọc qua màng PTFE 0,45 µm. Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký.

2.2.2.3. Thẩm định quy trình phân tích đã chọn

Quy trình phân tích được thẩm định theo hướng dẫn của FDA [26] về các chỉ tiêu tính đặc hiệu (chọn lọc), đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết và độ ổn định mẫu.

a.Kiểm tra tính tương thích hệ thống

Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện. Yêu cầu:RSD % của: (i) thời gian lưu hoặc thời gian di chuyển ≤ 2 %, (ii) tỷ số diện tích pic (RS/IS) của chất cần định lượng ≤ 2 %. Hệ số T từ 0,8 ≤ T ≤ 1,5 và độ phân giải giữa các pic cần định lượng Rs ≥ 1,5 [26].

b.Tính đặc hiệu

Tiến hành sắc ký mẫu pha động, mẫu đối chiếu trong pha động, mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa thử và mẫu huyết tương chứa thử thêm chất đối chiếu được xử lý theo quy trình tối ưu được chọn từ kết quả khảo sát các phương pháp xử lý mẫu. Ghi lại các sắc ký đồ và đánh giá độ tinh khiết tín hiệu sắc ký bằng đầu dò dãy diod quang.

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau [26]:

 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu pha động không có các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu.

 Sắc ký đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu đối chiếu.

 Độ tinh khiết pic của các pic cần định lượng trong mẫu thử phải đạt theo cách xác định độ tinh khiết pic tính từ phần mềm của hệ thống.

 Khi thêm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic (S/IS) của chất cần định lượng. Hoặc sự tăng chiều cao pic sau khi thêm chất đối chiếu.

c.Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính

Đường chuẩn bao gồm 1 mẫu huyết tương trắng và 5 mẫu huyết tương có pha SW và IS. Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 thêm 400 l huyết tương để thu được các mẫu của đường chuẩn có nồng độ từ 500 – 1000 – 2000 – 4000 – 8000 ng/ml sau khi sử lý mẫu.

Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn trong huyết tương được trình bày ở Bảng 2.3.

Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu đối chiếu

Mẫu trắng Mẫu chuẩn

S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (ng/ml) 500 1000 2000 4000 8000 Thể tích huyết tương (µl) 400 400 400 400 400 400 Thể tích chất nội chuẩn (µl) 50 50 50 50 50 50 Thể tích dung dịch SW1 (µl) - - - 25 50 100 Thể tích dung dịch SW2 (µl) - 50 100 - - - Thể tích MeOH (µl) 100 50 - 75 50 -

Định lượng 2 lần cho mỗi mẫu, tính giá trị trung bình, dựa vào đường chuẩn tính lại độ đúng tại mỗi điểm nồng độ. Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích