Qui trình nghiên cứu được thực hiện qua các giai đoạn như Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu
2.2.2.1. Xây dựng điều kiện sắc ký
Nghiên cứu xây dựng điều kiện sắc ký được thực hiện trên máy HPLC Agilent Xây dựng điều kiện sắc ký
Phương pháp xử lý mẫu
Thẩm định quy trình phân tích đã chọn
các chất nghiên cứu, sử dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo, đề tài thực hiện khảo sát các điều kiện sắc ký trên cột sắc ký C18 150 x 4,6 mm; 5 µm với cột bảo vệ cùng loại:
Bước sóng phát hiện: Áp dụng bước sóng được khảo sát từ các dung dịch chuẩn OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH được các dung dịch OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có nồng độ khoảng 5 µg/ml. Tiến hành quét phổ hấp thu UV trên máy quang phổ UV 1800 (Shimadzu) của 4 dung dịch, chọn bước sóng phát hiện phù hợp.
Pha động: Thăm dò một số pha động, sử dụng hỗn hợp pha động là MeOH, ACN, phối hợp với dung dịch có pH thay đổi (dung dịch đệm hoặc dung dịch kiềm) ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân đối của pic đạt yêu cầu.
Tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu: được khảo sát đồng thời. Chọn điều kiện sắc ký sao cho pic PPIs và IDM tách hoàn toàn nhau và tách khỏi các pic tạp và đạt độ tinh khiết cần thiết cho định lượng và các thông số sắc ký đạt yêu cầu. Lựa chọn điều kiện sắc ký sao cho [26]:
Hệ số phân giải giữa các chất không nhỏ hơn 1,5. Số đĩa lý thuyết của các pic không nhỏ hơn 3000. Hệ số bất đối xứng của các pic từ 0,9 đến 1,5. Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 20 phút.
RSD % của thời gian lưu của các pic với 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %.
RSD% của tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/nội chuẩn của 6 lần tiêm lặp lại ở nồng độ định lượng không lớn hơn 2,0 %.
2.2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu
Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết tách sau đây:
Phương pháp gây tủa protein bằng dung môi hữu cơ: Từ mẫu thử giả lập, thêm tiếp 50 µl dung dịch KOH 0,25 M và 1,2 ml dung dịch MeOH hoặc ACN, vortex trong 5 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy dịch nổi, lọc qua màng PTFE 0,22 µm. Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký. Tiến hành song song với mẫu được chiết không kiềm hóa.
Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng: Từ mẫu thử giả lập, thêm tiếp 4,5 ml hỗn hợp dung môi diethyl ether - triethylamin (99 : 1), vortex trong 5 phút. Đem ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phút. Lấy 3 ml dịch nổi, bốc hơi ở 40 C bằng máy ủ nhiệt khô, cắn thu được đem hòa tan vào 1 ml dung dịch pha động, lọc qua màng PTFE 0,45 µm. Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký.
2.2.2.3. Thẩm định quy trình phân tích đã chọn
Quy trình phân tích được thẩm định theo hướng dẫn của FDA [26] về các chỉ tiêu tính đặc hiệu (chọn lọc), đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết và độ ổn định mẫu.
a.Kiểm tra tính tương thích hệ thống
Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện. Yêu cầu:RSD % của: (i) thời gian lưu hoặc thời gian di chuyển ≤ 2 %, (ii) tỷ số diện tích pic (RS/IS) của chất cần định lượng ≤ 2 %. Hệ số T từ 0,8 ≤ T ≤ 1,5 và độ phân giải giữa các pic cần định lượng Rs ≥ 1,5 [26].
b.Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký mẫu pha động, mẫu đối chiếu trong pha động, mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa thử và mẫu huyết tương chứa thử thêm chất đối chiếu được xử lý theo quy trình tối ưu được chọn từ kết quả khảo sát các phương pháp xử lý mẫu. Ghi lại các sắc ký đồ và đánh giá độ tinh khiết tín hiệu sắc ký bằng đầu dò dãy diod quang.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau [26]:
Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu pha động không có các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu.
Sắc ký đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu đối chiếu.
Độ tinh khiết pic của các pic cần định lượng trong mẫu thử phải đạt theo cách xác định độ tinh khiết pic tính từ phần mềm của hệ thống.
Khi thêm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic (S/IS) của chất cần định lượng. Hoặc sự tăng chiều cao pic sau khi thêm chất đối chiếu.
c.Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính
Đường chuẩn bao gồm 1 mẫu huyết tương trắng và 5 mẫu huyết tương có pha SW và IS. Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 thêm 400 l huyết tương để thu được các mẫu của đường chuẩn có nồng độ từ 500 – 1000 – 2000 – 4000 – 8000 ng/ml sau khi sử lý mẫu.
Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn trong huyết tương được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu đối chiếu
Mẫu trắng Mẫu chuẩn
S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (ng/ml) 500 1000 2000 4000 8000 Thể tích huyết tương (µl) 400 400 400 400 400 400 Thể tích chất nội chuẩn (µl) 50 50 50 50 50 50 Thể tích dung dịch SW1 (µl) - - - 25 50 100 Thể tích dung dịch SW2 (µl) - 50 100 - - - Thể tích MeOH (µl) 100 50 - 75 50 -
Định lượng 2 lần cho mỗi mẫu, tính giá trị trung bình, dựa vào đường chuẩn tính lại độ đúng tại mỗi điểm nồng độ. Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau: Hệ số tương quan tuyến tính r phải lớn hơn 0,995; ít nhất 75 % số điểm của đường chuẩn bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20% [9], [13], [26].
d.Giới hạn định lượng dưới
Nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (LLOQ) có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó, giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy của phương pháp. Trong nghiên cứu, giá trị LLOQ được xác định dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ đốc đường tuyến tính.
Công thức tính toán như sau:
a SD LLOQ 10.
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn đường tuyến tính a là hệ số gốc đường tuyến tính (y = a.x + b) LLOQ được chấp nhận nếu thỏa mãn điều kiện sau:
Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80 – 120 % so với nồng độ thực. Độ chính xác RSD ≤ 20 % [9], [13], [26].
e.Độ đúng và độ lặp lại
Tiến hành thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp trên 3 lô mẫu LQC 1000 ng/ml, MQC 3000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml. Xác định hàm lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong mẫu bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Với mỗi nồng độ tiến hành lặp lại trên 6 mẫu (độ đúng và độ lặp lại trong ngày) và trong 3 ngày liên tiếp (độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày).
Độ đúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ tìm được và nồng độ thêm vào, tỷ lệ này phải nằm trong khoảng từ 85 – 115 %, có thể chấp nhận 80 – 120 % đối với những điểm gần giới hạn định lượng dưới.
Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng RSD %, giá trị này không được vượt quá 15 %, riêng nồng độ gần với giới hạn định lượng dưới thì không được vượt quá 20 %. [9], [13], [26].
f. Hiệu suất chiết
Hiệu suất chiết hay còn gọi là tỷ lệ thu hồi được thẩm định bằng cách tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml trong dịch sinh học, mỗi lô mẫu gồm 6 mẫu độc lập. Xử lý mẫu theo quy trình nghiên
cứu, phân tích, ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic. Song song tiến hành với các lô mẫu QC trong pha động có nồng độ tương ứng.
Xác định tỷ lệ thu hồi của các PPIs và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của các PPIs và IS trong các mẫu QC pha huyết tương (có qua chiết tách) với đáp ứng của các PPIs và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách).
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau:
Hiệu suất chiết các nồng độ khác nhau không được quá ± 15 %.
Giá trị RSD % các đáp ứng của PPIs và IS trong các mẫu huyết tương ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [9], [13], [26].
g.Độ ổn định
Độ ổn định của thuốc trong huyết tương/ dịch sinh học nói chung phụ thuộc vào điều kiện bảo quản và định lượng, tính chất hóa học của thuốc, nền mẫu và đồ chứa. Trong nghiên cứu, thực hiện khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, độ ổn định ngắn hạn, độ ổn định dài hạn và độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – ra đông.
Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc: Phân tích và so sánh nồng độ của dung dịch chuẩn gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 °C trong 3 ngày với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng. Dung dịch chuẩn gốc được coi là ổn định nếu độ lệch giữa nồng độ trung bình của dung dịch sau bảo quản so với nồng độ trung bình của dung dịch mới pha ≤ 2 %. Giá trị RSD giữa các kết quả định lượng tại từng thời điểm phải ≤ 2 % [26].
Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian ngắn: Phân tích mẫu huyết tương ở 2 lô mẫu nồng độ LQC và HQC được pha chế và lưu trữ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi chuẩn bị. Nồng độ các PPIs trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15 % và giá trị RSD% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26].
Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài: Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35 ± 5 C, phân tích mẫu tại thời điểm
ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản sau 15 ngày và sau 30 ngày. So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. Nồng độ các PPIs trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị RSD % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26].
Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rãđông: Khảo sát độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông thực hiện trên 2 lô mẫu nồng độ LQC và HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35 ± 5 °C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24 giờ. Lặp lại chu kì đông - rã đông 2 lần nữa. Sau 3 chu kỳ đông – rã đông, tiến hành xử lý mẫu, phân tích xác định nồng độ các PPIs có trong mẫu. So sánh với nồng độ các PPIs có trong các lô mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu).
Nồng độ các PPIs trong mẫu sau 3 chu kỳ đông – rã đông phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị RSD % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26].