STT Phân đoạn Dung môi giải ly
Khối lượng
(mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú
1 EA4.7.1 C:Me (95:5) 68.1 Nhiều vết, kéo
vệt Đã khảo sát 2 EA4.7.2 C:Me (95:5) 71.2 Nhiều vết, kéo
3 EA4.7.3 C:Me (9:1) 100.7 Nhiều vết, tách rõ
Tinh chế thu được hợp
chất PA2
4 EA4.7.4 C:Me (9:1) 69.8 Nhiều vết, kéo
vệt Đã khảo sát 5 EA4.7.5 C:Me (9:1) 59.9 Nhiều vết, kéo
vệt Đã khảo sát 6 EA4.7.6 C:Me (8:2) 51.1 Nhiều vết, kéo
vệt Đã khảo sát Phân đoạn EA4.7.3 (100.7mg) của bảng 2.5 khi SKLM cho vết màu nâu, hiện hình UV và có bốn vết dơ không hiện hình dưới đèn tử ngoại nhưng tách rõ, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi C:Ac:AcOH thu được hợp chất có dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PA2 (10.9mg).
Dưới đây là sơ đồ trình bày quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Khảo sát cấu trúc hợp chất PEE04
Hợp chất PEE04 (5.8mg) thu được từ phân đoạn EA4.6.3 có những đặc điểm như sau:
- Dạng hình kim, màu trắng.
- Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình dưới đèn tử ngoại và khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu xanh. (dung môi giải ly chloroform : acetone (9:1), Rf = 0.4)
- Phổ 1H–NMR (CDCl3, phụ lục 1, bảng 3.1) δH (ppm): 5.88 (1H, s, H–22), 4.98 (1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H–21a) , 4.81 (1H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H–21b), 4.18 (1H, brs, H–3), 2.78 (1H, m, H–17), 0.95 (3H, s, H–19), 0.88 (3H, s, H– 18). - Phổ 13C kết hợp với DEPT–NMR (CDCl3, phụ lục 2, 2a và 3, bảng 3.1) δC (ppm): 174.5, 174.4 (>C=O, >C=C, C–20/23), 117.8 (=CH–, C–22), 16.7 (– CH3, C–19), 15.7 (–CH3, C–18) và độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.1.
- Phổ HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 4, 5).
BIỆN LUẬN CẤU TRÚC
Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của một proton olefin tại δH 5.88 (1H, s, H–22). Phổ đồ còn thể hiện hai tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methylene gắn với oxygen tại δH 4.98 (1H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H–21a) và 4.81 (1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H–21b), tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl –CH3 tại δH 0.95 (3H, s, H–19), 0.88 (3H, s, H–18). Ngoài ra, một số tín hiệu cộng hưởng của các proton methylene –CH2– và methine >CH– cũng xuất hiện trên phổ ở vùng từ trường cao.
Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT và HSQC của hợp chất PEE04 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 23 carbon, gồm hai carbon methyl, mười carbon
methylene, năm carbon methine và sáu carbon bậc bốn. Trong đó, tín hiệu cộng hưởng của vòng lactone không no 𝛼, 𝛽 ở δC 174.5 (>C=O, C–23), 174.4 (>C=C, C–20), 117.8 (=CH–, C–22), 73.5 (–CH2–O, C–21). Ngoài ra, phổ đồ còn có tín hiệu cộng hưởng của hai carbon tứ cấp mang oxygen tại δC 85.5 (C–14), 74.6 (C–5) và carbon oxymethine tại δC 68.1 (>CH–O–, C–3). Tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl bậc 4 tại δC 16.7 (–CH3, C–19) và 15.7 (–CH3, C–18).
Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PEE04 được dự đoán là steroid có khung sườn pregnane với một nhóm C=O được gắn trong vòng lactone không no và ba nhóm hydroxyl.
Tương quan HMBC của proton tại δH 2.78 (1H, m, H–17) với các carbon ở δC 174.4 (>C=, C–20), 117.8 (>C=CH–, C–22), 85.5 (>C<, C–14), 73.5 (–CH2–, C–21), 49.5 (>C<, C–13), 40.1 (–CH2–, C–12) và 26.8 (–CH2–, C– 16) giúp dự đoán vòng lactone không no gắn ở vị trí carbon C–17. Ngoài ra, tương quan HMBC từ proton methyl tại δH 0.88 (3H, s, H–18), proton tại δH
2.78 (1H, m, H–17) đến carbon mang oxygen tại δC 85.5 (C–14) xác định nhóm hydroxyl gắn tại C–14. Tương tự, tương quan HMBC từ proton H–3 (δH 4.18) và proton methyl H–19 (δH 0.95) đến C–5 (δC 74.6) giúp xác định nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C–5. Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.1.
Qua các dữ kiện phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp chất periplogenin [9] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PEE04