3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG NHO
3.2. ỨNG DỤNG CỦA CÁC ENZYME TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG NHO
NHO
3.2.1. Enzyme pectinase3.2.1.1. Cấu tạo 3.2.1.1. Cấu tạo
Enzyme pectinase thuộc nhóm enzyme thủy phân. Nó sử dụng cơ chất là pectin và sản phẩm sau khi thủy phân là acid pectic và methanol. Enzyme pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng làm trong. (Nam Pro, 20/05/2013)
Enzyme pectinase cũng như hầu hết các enzyme khác là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu cơ chất cao. Các chất xúc tác này thường có cấu trúc rất phức tạp và thường để đảm bảo có tính xúc tác, enzyme có cấu trúc bậc IV.
Trong cấu tạo bậc IV, nhờ vào tương tác hóa học giữa các thành phần mà chúng hình thành nên trung tâm hoạt động. Enzyme polygalacturonase (pectinase) chứa 1 vùng 8 - 10 vịng xoắn kép về phía phải với 2 vòng sẽ tạo thành 1 khe liên kết với cơ chất. Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa 2 acid amin là aspartat và lysin. Thì có một histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme.
Image 9: Cấu trúc không gian Enzyme pectinase
3.2.1.2. Tính chất
Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –
α - D - 1,4 galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1 - O glucozit còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic. Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic.
Trong thực tế khơng phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose cũng bị methyl hóa (tạo este metylic), mà đơi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên
18
dạng –COO. Ngư i ta cho rằng protopectin là hợp chất giữa pectin và araban, galactose hay tinh bột.
Trọng lượng phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC.
Phân loại
Enzyme pectinase gồm 3 loại nhóm chính:
Pectinesterase
Các enzyme khử mạch polymer Protopectinase
Image 10: Sơ đồ phân loại enzyme pectinase
Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khác nhau như pectinesterase polygalacturonase,… xúc tác thủy phân các phân tử pectin thành các sản phẩm khác nhau. PE(pectinesterase) xúc tác thủy phân liên kết ester của acid pectic với nhóm metyl giải phóng ra pectate và metanol.
Các pectate dễ kết lắng trong điều kiện có in Ca 2+, làm cho sản phẩm kém ổn định, đồng thời rượu metanol là thành phần không mong muốn trong sản phẩm. PG (polygalacturonase) xúc tác thủy phân liên kết alpha-1,4-D-galacturonic trong phân tử pectin tạo thành acid galacturonic có phân tử nhỏ và khó kết lắng, giúp sản phẩm ổn định hơn.
19
Enzyme Pectinesterase (PE)(EC.3.1.11.1), hay còn được gọi là với một số tên khác như pectinmetylesterase, pectinase, pectin methoxyl ase và pectol lipase, thuộc nhóm enzyme thủy phân.
Enzyme polygalacturonase (PG) là enzyme xúc tác sự thủy phân liên kếtα - 1,4 glucoside trong phân tử pectine. Polygalacturonase là phức hệ g m nhiều enzyme thường có tính đặc hiệu cao với cơ chất
Polymethylgalacturonase tác dụng chủ yếu lên các ester etylic của các polygalacturonic. Các enzyme này được chia thành 2 nhóm nhỏ tùy theo liên kết glycoside bị cắt đứt: endo - glucosidase polymethyl - galacturonase (phân cắt ngẫu nhiên liên kết 1,4 glycoside của pectin) và exo-glucosidase-polymethyl galacturonase (phân cắt lần lượt các liên kết α - 1,4 glycosid của mạch pectin từ đầu không khử). Polygalacturonase tác d ng chủ yếu lên acid pectin và pectic. Các enzyme này cũng được chia làm 2 nhóm dựa vào vị trí liên kết glycoside bị thủy phân. G m: endo-glucosidase - polygalacturonase và exo – glucosidase - polygalacturonase.
3.2.2. Enzyme Laccase: Cơng đoạn sunfit hóa
3.2.2.1. Cấu tạo
Laccase: người ta tìm thấy laccase trong giống nho bị nhiễm Botrytis Cinerea (do Botrytis Cinerea sinh tổng hợp ra). Laccase có khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa nhiều hợp chất phenolic. Enzyme này bền với SO2 và q trình xử lý với bentonite khơng thể tách được hồn tồn laccase ra khỏi bán thành phẩm. Có thể dùng phương pháp siêu lọc để loại bỏ laccase hoặc dùng phương pháp thanh trùng nhiệt để vô hoạt enzyme.
Laccase được cấu tạo từ các glycoprotein, với phần carbohydrat góp phần tạo nên mức độ ổn định của enzyme. Tất cả các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng thuộc 3 loại khác nhau nằm ở các vị trí khác nhau của enzyme. Bốn nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hố khi liên kết với anion mạnh.
Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phân (vùng) chính A, B, C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trị trong q trình xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C.
3.2.2.2. Tính chất
Laccase có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 40 - 60 kDa. Giá trị pH hoạt động tối thích của laccase nằm trong vùng acid và phụ thuộc nhiều vào cơ chất. Khi sử dụng ABTS là cơ chất thì pH tối ưu cho laccase thường là 3. Tuy nhiên, đối với q trình oxi hố các hợp chất phenol như DMP, guanial và syringaldazine, giá trị pH tối ưu cho hoạt động của 9penzyme cao hơn, từ 4.0 - 7.0.
Độ bền pH của các laccase khác nhau khá nhiều, đa phần các laccase bền ở pH 6. Độ bền pH của laccase từ T. versicolor nằm trong dải pH từ 2.5 7 sau một giờ ủ còn trên 50%.
Khoảng nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thường trong khoảng 25 – 300 oC tuỳ vào từng loại cơ chất xúc tác và các loại laccase khác nhau. Với cơ chất là ABTS laccase thường hoạt động trong khoảng 27 – 300 oC, với cơ chất là DMP laccase hoạt
20
động ở 25 – 300 oC. Nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thay đổi trong khoảng 25- 800 oC, một vài loại enzyme có nhiệt độ hoạt động tối thích dưới 350 oC. Nhiệt độ hoạt động tối thích của laccase từ P. ostreatus nằm trong khoảng 25-350 o
C.
2.2.2.3 Cơ chế hoạt động
Laccase là enzyme oxy hố khử có khả năng oxy hố diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hoá cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời bốn điện tử từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptit bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hố laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước. Tất cả các ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của laccase. Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hoá cơ chất. T1 nhận điện tử đầu tiên từ cơ chất, sau đó điện tử này được vận chuyển qua bộ ba acid amin (His-Cys -His) đến vị trí T2/T3. Phân tử oxy sau đó nhận điện tử và bị khử thành nước. Trong công nghệ tổng hợp các hợp chất hay trong các công nghệ khác, thì cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế. Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hoá trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do bốn nguyên tử đồng đảm nhiệm.
3.2.3. Enzyme protease: Công đoạn lên men
3.2.3.1. Cấu tạo
Enzyme Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton
3.2.3.2. Tính chất
Trong sản xuất rượu vang, người ta thường sử dụng chế phẩm enzyme hỗn hợp. Các enzyme này cùng lúc tham gia phân giải pectin, protein, cellulose, hemicellulose và nhiều chất khác.
- Nhóm các enzyme phân giải protein
Các chế phẩm protease từ Aspergillus orgyzae, Asp.flawusi casein ở pH 7,7. Ngược lại protease từ Aspergillus awamori lại hoạt động ở pH acid. Tác động của protein dịch nho gần giống như albunin và ɣ globulin. Các protease của Aspergillus niger cũng giống như protease Aspergillus awamori. Chúng hoạt động cả trong môi trường acid mạnh (pH 1,8 – 2,0) và hoạt động mạnh ở nhiệt độ 40oC. Các chế phẩm enzyme protease acid thường được sử dụng để xử lý dịch nho.
- Nhóm enzyme phân giải hemicellulose và cellulose
Khi cho các chế phẩm enzyme phân giải pectin vào dịch nho nghiền, trong dịch nho sẽ tăng hàm lượng các chất phenol tinh dầu, các hợp chất chứa nitơ và các chất khô trong dịch nho. Trong xử lý nước nho, người ta sử dụng cả phức hợp cenllulase. Các chế phẩm cellulase sử dụng trong sản xuất rượu vang hồn tồn khơng phải là các chế phẩm tinh khiết mà là phức hợp enzyme bao gồm nhiều enzyme khác như pectinase và protease…
3.2.3.3. Cơ chế tác dụng
21
Cơ chế tác dụng Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ q trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất thành hợp chất trung gian.
Mặc dù trung tâm hoạt động của protase vi sinh vật có khác nhau nhưng chúng đều xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptide theo cùng cơ chế chung như sau: E+S=>ES=>ES’+P1=>E+P2
Trong đó:
E: Enzyme
S: Cơ chất
ES: phức chất enzyme – cơ chất
ES’: phức chất trung gian enzyme - cơ chất acyl hoá (acyl enzyme) P1: sản phẩm đầu tiên của chuỗi phản ứng.
P2: sản phẩm thứ hai của chuỗi phản ứng