1. Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam
3.3. Đặc điểm phân tử vùng gen COI của quần thể và các loài Bungarus
3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số mẫu giống Rắn cạp nia
Bungarus ở Việt Nam
Tách chiết ADN tổng số nhằm mục đích thu nhận ADN ra khỏi cấu trúc tế bào. Điều quan trọng nhất là thu nhận được ADN ở trạng thái còn nguyên vẹn không bị phân hủy và không lẫn nhiều tạp chất để có nguồn nguyên liệu chất lượng tốt cho các thí nghiệm tiếp theo. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ Kit GeneJet PCR Purification (Thermo Fisher Scientific) để tách chiết ADN tổng số từ 09 mẫu cơ và gan của giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam (Bảng 3.2). Kết quả điện di kiểm tra ADN trên gel agarose 1% (Hình 3.8) cho thấy mỗi giếng chỉ cho một vạch băng duy nhất, các băng đậm, sắc nét thể hiện ADN đã tách chiết được. Kiểm tra hàm lượng và độ sạch của ADN tách được bằng phương pháp quang phổ trên máy NanoDrop 2000 thì các mẫu ADN được đo quang phổ hấp thụ ở dải bước sóng 260nm và 280nm. Tỉ lệ OD260nm/OD280nm của các mẫu dao động trong phạm vi cho phép từ 1,8 đến 2,0 (Bảng 3.2), điều này chứng tỏ các mẫu ADN tổng số tách chiết được đảm bảo độ tinh sạch để làm khuôn thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu. Các mẫu ADN tổng số được pha loãng bằng H2O deion về hàm lượng 20 ng/µl để bảo quản và thực hiện phản ứng PCR
42
Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số 09 mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam trên gel agarose 1% (các giếng từ 1-9 là thứ tự các mẫu tương ứng với số thứ tự trong bảng 3.2).
Bảng 3.3. Độ sạch và hàm lượng ADN của 09 mẫu giống Rắn cạp nia
Bungarus ở Việt Nam
STT Mẫu
nghiên cứu Tên loài OD260nm OD280nm
Độ sạch ADN (OD260nm/280nm) Hàm lượng ADN (ng/µl) 1 IEBR 4057 B. candidus 0,092 0,048 1,917 920 2 IEBR.KH 201695 B. candidus 0,083 0,044 1,886 830 3 IEBR.NT 201694 B. candidus 0,075 0,039 1,923 750 4 VNMN 011010 B. candidus 0,087 0,051 1,706 870 5 VNMN 011012 B. candidus 0,069 0,036 1,917 690 6 VNMN 011013 B. candidus 0,088 0,047 1,872 880 7 VNMN 011014 B. candidus 0,070 0,041 1,707 700 8 VNMN 011015 B. candidus 0,069 0,041 1,683 690 9 IEBR 3906 B. slowinskii 0,081 0,048 1,688 810
43
Bảng 3.4. Thông tin các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên loài Số hiệu
Genbank
Số hiệu bảo tàng
Địa điểm
thu mẫu Tài liệu
1 Bungarus candidus KY769757 MVZ 258148 Virachey NP, Ratanakiri, Cambodia Nguyễn và cs. 2017
2 B. candidus KY769758 KIZ 100 Bu Gia Map NP, Binh Phuoc, Vietnam Nguyễn và cs. 2017
3 B. candidus ‒ IEBR 4057 Bình Định Nghiên cứu này
4 B. candidus ‒ KH 201695 Cam Lâm, Khánh Hòa Nghiên cứu này
5 B. candidus ‒ NT 201694 VQG Núi Chúa, Ninh Thuận Nghiên cứu này
6 B. candidus ‒ VNMN 011010 Vĩnh Sơn, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc Nghiên cứu này
7 B. candidus ‒ VNMN 011012 Vĩnh Sơn, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc Nghiên cứu này
8 B. candidus ‒ VNMN 011013 Vĩnh Sơn, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc Nghiên cứu này
9 B. candidus ‒ VNMN 011014 Vĩnh Sơn, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc Nghiên cứu này
10 B. candidus ‒ VNMN 011015 Vĩnh Sơn, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc Nghiên cứu này
11 B. “wanghaotingi” MN165152 CIB104228 Nanning Zoo, Guangxi, China (locality
uncertain) Chen và cs. 2021
12 B. multicinctus MN165153 CIB DL18090209 Wuyi Moutain, Fujian, China Chen và cs. 2021
13 B. multicinctus MN165154 CIB DL18090210 Wuyi Moutain, Fujian, China Chen và cs. 2021
14 B. multicinctus MN165151 CIB93923 Guangxi, China Chen và cs. 2021
15 B. multicinctus MN165150 SYNU R180305 Haikou, Hainan, China Chen và cs. 2021
16 B. multicinctus KP749805 RN0296 Taiwan, China Chen & Lin, 2015
17 B. multicinctus KP749806 RN0304 Taiwan, China Chen & Lin, 2015
44
19 B. multicinctus KP749815 RN0893 Taiwan, China Chen & Lin, 2015
20 B. multicinctus KP749818 RN1073 Taiwan, China Chen & Lin, 2015
21 B. multicinctus KP749820 RN1198 Taiwan, China Chen & Lin, 2015
22 B. multicinctus KP749821 RN1231 Taiwan, China Chen & Lin, 2015
23 B. “wanghaotingi” MN165149 CIB104227 Beiliu, Guangxi, China Chen và cs. 2021
24 B. “wanghaotingi” MN165147 SYNU R170408 Bang Lang National Park, Yala, Thailand Chen và cs. 2021
25 B. “wanghaotingi” MN165158 CIB ML20170801 Menglun, Yunnan, China Chen và cs. 2021
26 B. “wanghaotingi”
MN165157 CIB
MLMY20170801 Mengla, Yunnan, China Chen và cs. 2021
27 B. “wanghaotingi” MN165159 JK20181101 Jinghong, Yunnan, China Chen và cs. 2021
28 B. candidus KY769759 KIZ 1326 Ta Kou NR, Binh Thuan, Vietnam Nguyễn và cs. 2017
29 B. candidus KY769760 ITBCZ 900 Nui Chua NP, Ninh Thuan, Vietnam Nguyễn và cs. 2017
30 B. candidus KY769761 ITBCZ 1040 Nui Chua NP, Ninh Thuan, Vietnam Nguyễn và cs. 2017
31 B. candidus KY769762 HUS 300 Bach Ma NP, Thua Thien–Hue, Vietnam Nguyễn và cs. 2017
32 B. fasciatus KY769766 MVZ226610 Tam Dao NP, Vinh Phuc, Vietnam Nguyễn và cs. 2017
33 B. magnimaculatus KY769768 CAS 210526 Alaungdaw Kathapa, Sagaing, Myanmar Nguyễn và cs. 2017
34 B. magnimaculatus KY769769 CAS 210696 Sin Ma Taung, Magway, Myanmar Nguyễn và cs. 2017
35 B. magnimaculatus KY769770 CAS 215445 Alaungdaw Kathapa, Sagaing, Myanmar Nguyễn và cs. 2017
36 B. magnimaculatus KY769771 CAS 215958 Min Sone Taung, Mandalay, Myanmar Nguyễn và cs. 2017
37 B. magnimaculatus KY769772 CAS 215998 Min Sone Taung, Mandalay, Myanmar Nguyễn và cs. 2017
38 B. magnimaculatus KY769773 CAS 215999 Min Sone Taung, Mandalay, Myanmar Nguyễn và cs. 2017
45
40 B. suzhenae MN165156 CIB116089 Yingjiang, Yunnan, China Chen và cs. 2021
41 B. slowinskii ‒ IEBR 3906 Xuân Liên, Thanh Hóa Nghiên cứu này
46
3.3.2. Nhân bản trình tự ADN đích vùng gen COI mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam. cạp nia Bungarus ở Việt Nam.
Cặp mồi vùng gen COI đã nhân bản thành công ở nhiệt độ gắn mồi là 570C cho 09 mẫu nghiên cứu. Sản phẩm PCR lần lượt có kích thước khoảng 670bp (Hình 3.9). Chất lượng của sản phẩm PCR được thể hiện khi điện di trên gel Agarose đệm TBE 1% các băng sáng đậm, đủ tiêu chuẩn để giải mã trình tự nucleotide cho các mẫu trong nghiên cứu.
Hình 3.10. Sản phẩm PCR của 09 mẫu mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam phân tích với cặp mồi COI điện di trên gel agarose 1% (M: Marker phân tử 100bp; VQN1-9: ký hiệu mẫu)
3.3.3. Xác định trình tự nucleotide vùng gen COI của các loài trong giống Bungarus tại Việt Nam giống Bungarus tại Việt Nam
a. Trình tự đoạn gen COI của loài B. candidus
Sản phẩm PCR sau khi giải trình tự hai chiều với cặp mồi COItại phòng thí nghiệm Hệ thống học và tiến hoá động vật, Trường Đại học Kyoto, Nhật Bản. Kết quả giải trình tự được xác thực bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng gen để tiến hành phân tích định loại 9/9 mẫu. Chúng tôi nhận thấy chiều dài đoạn gen COI của các mẫu 670bp khi chưa xử lý đoạn nhiễu. Kết quả này tương đối đồng đều giữa các mẫu và với kết quả điện di.
47
Hình 3.11. Sơ đồ các peak trong giải trình tự vùng gen COI của loài Rắn cạp nia nam B. candidus
Kết quả giải trình tự đoạn gen COIcủa loài B. candidus (IEBR.4057) như sau:
> COI. CACCTTATACCTACTCTTCGGAGCATGGTCTGGTCTAATCGGAG CCTGTCTAAGCATTTTAATACGCATAGAGTTAACCCAACCCGGC TCGCTTTTAGGAAGTGACCAAATCTTTAACGTACTAGTTACTGC CCACGCATTTATCATAATTTTCTTTATAGTCATACCAATCATAAT CGGAGGGTTTGGCAACTGACTTATCCCTTTAATAATCGGCGCCC CTGATATAGCCTTTCCACGAATAAACAATATAAGCTTCTGGCTC CTCCCACCAGCACTACTCCTTCTCCTATCCTCCTCTTATGTAGAA GCCGGTGCCGGCACAGGTTGAACAGTCTACCCGCCCCTATCGG GTAACCTAGTTCACTCAGGCCCATCAGTAGACTTAGCTATCTTC TCTCTACATTTAGCAGGAGCCTCCTCCATCCTAGGAGCAATCAA TTTTATTACAACATGCATTAATATAAAACCTAAATCAATACCAA TATTTAATATTCCATTATTCGTTTGATCAGTATTAATCACAGCCA
48
TTATACTTCTTCTAGCCCTACCAGTTCTAGCTGCCGCAGTTACAA TACTTTTAACCGATCGTAATCTCAATACATCCTTCTTTGACCCTT CTGGGGGAGGAGACCCGGTCCTATTCCAACACCTATTC
b. Trình tự đoạn gen COI của loài B. slowinskii
Sản phẩm PCR sau khi giải trình tự bởi phòng thí nghiệm Hệ thống học và tiến hoá động vật, Trường Đại học Kyoto, Nhật Bản với cặp mồi COI. Chúng tôi nhận thấy chiều dài đoạn gen COI của các mẫu 670bp khi chưa xử lý đoạn nhiễu. Kết quả này tương đối đồng đều giữa các mẫu và với kết quả điện di.
Hình 3.12. Sơ đồ các peak trong giải trình tự vùng gen COI của loài Rắn cạp nia sông hồng B. slowinskii
49
Kết quả giải trình tự đoạn gen COIcủa loài B. slowinskii như sau:
> COI. CACTCTGTACTTATTATTCGGGGCCTGATCAGGCCTGGTTGGAG CCTGTCTAAGCATCCTGATACGCATAGAACTAACCCAACCCGGA TCGCTATTTGGCAGTGACCAAATCTTCAATGTATTAGTTACCGC CCACGCATTCATCATAATCTTCTTCATAGTAATACCCATTATAAT TGGTGGTTTCGGCAACTGACTTATCCCTTTAATAATTGGAGCCC CAGATATAGCTTTTCCACGGATAAATAATATAAGCTTTTGACTC CTCCCACCAGCACTCTTTCTCCTCCTATCCTCCTCCTATGTAGAA GCCGGAGCCGGCACAGGATGAACAGTTTACCCGCCCCTATCGG GAAACCTGGTCCACTCGGGCCCATCAGTCGACTTAGCTATTTTC TCACTACATTTGGCAGGAGCCTCCTCCATCCTAGGGGCAATTAA CTTCATTACAACATGCATCAACATAAAACCTAAATCAATACCAA TATTCAACATCCCTTTATTCGTCTGATCGGTACTGATCACCGCTA TTATACTCCTACTTGCCCTACCAGTTCTGGCAGCCGCAGTCACC ATACTTTTAACTGACCGTAATCTCAACACATCCTTCTTCGACCCT TGTGGAGGAGGAGACCCAATTCTATTCCAACACCTATTC
3.3.4 Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Bungarus tại Việt Nam Việt Nam
Tổng số 42 trình tự đoạn gen COI thuộc giống Bungarus có chiều dài 658 bp, trong đó 33 trình tự được tham khảo trên Genbank, 9 trình tự mới từ nghiên cứu này.
Trong 658 bp, số vị trí bảo thủ là C=504/658, số vị trí đa dạng V=154/658, số vị trí đơn nhất là S=65/658. Tỉ lệ thành phần các loại Bazơ nitơ là T= 30,6; C=27,5; A=26,8; G=15,2. Loài Naja naja (DQ343648) (Yan và cs. 2008) được sử dụng làm nhóm ngoài phân tích.
Cây quan hệ di truyền được được xây dựng dựa trên phương pháp phân tích MrBayes có trong phần mềm Kakusan, giá trị -Lnl của mô hình là 2232,64700, tham số mô hình Gama là 0,146.
Các loài thuộc giống Bungarus nằm trên cùng một nhánh của cây quan hệ di truyền, tách biệt hoàn toàn với nhánh ngoài (chỉ có loài Naja naja) với giá trị xác suất hậu nghiệm gốc nhánh đạt tuyệt đối 100% (Hình 3.12).
50
tách thành 4 phân nhánh A, B, C, D trong đó:
Phân nhánh A gồm các trình tự các mẫu vật được xác định là B. candidus
và B. multicinctus, giá trị xác suất hậu nghiệm gốc nhánh gần tuyệt đối (98/100).
Phân nhánh B gồm các trình tự các mẫu vật được xác định là B. magnimaculatus và B. suzhenae, giá trị xác suất hậu nghiệm gốc nhánh cao (87/100).
Phân nhánh C gồm các trình tự đoạn gen COI của mẫu vật được xác định là B. fasciatus
Phân nhánh D là trình tự đoạn gen COI của mẫu vật được xác định là B. slowinskii, giá trị xác suất hậu nghiệm gốc nhánh tuyệt đối.
Phân nhánh A gồm 3 nhóm A1, A2, A3:
Nhóm A1: gồm các mẫu vật thu từ Bình Định, Bình Thuận, Ninh Thuận, Vĩnh Phúc, Vân Nam, Thừa Thiên Huế, Johor (Ma-lai-xi-a), Ratanakiri, Cambodia, Bình Phước, Yala (Thái Lan), Đài Loan, Phúc Kiến (Trung Quốc), Quảng Tây (Trung Quốc), Nê-pan, Pa-ki-xtan, khoảng cách di truyền từ 0,00% đến 2,60%. Trong đó nhóm mẫu vật được thuộc nhánh A1 có sai khác về di truyền từ 0,00-1,41% (Bảng 3.4).
Nhóm A2 có sai khác di truyền trong khoảng 0,18%-1,63%. Nhóm A3 có sai khác di truyền trong khoảng 0,00-0,33%. Sai khác di truyền giữa nhóm A1 và A2 khoảng 0,88-2.45%. Sai khác di truyền giữa nhóm A1 và A3 khoảng 1,06-2.60%, và nhóm A2 và A3 khoảng 0,88-1.79% (Bảng 3.4). Trong nghiên cứu của Chen và cs. 2021, nhóm tác giả cho rằng các mẫu vật có mã genbank gồm MN165149, MN165147, MN165158, MN165157, MN165159, KY769759, KY769760, KY769761, KY769762 được định danh là B. wanghaotingi và mẫu vật kí hiệu MN165148, KY769757, KY769758 được định danh là B. candidus. Kết quả nghiên cứu này có kết quả gần tương tự như của Chen và cs. 2021.
Với nhóm mẫu vật ở nhánh A1 và A2, lý giải sự khác biệt của 2 nhóm này với nhóm A3 như sau: tuy có sự sai khác di truyền giữa nhóm A1 và A2
51
khoảng 0,88-2.45%, nhóm A1 và A3 khoảng 1,06-2.60%, và nhóm A2 và A3 khoảng 0,88-1.79%, việc định danh nhóm A1 và A2 là loài B. candidus và nhóm A3 là loài B. multicinctus là chưa thực sự tin tưởng do số lượng mẫu vật trong nghiên cứu còn ít, chưa đủ lớn và chỉ thực hiện trên một đoạn gen COI, tuy nhiên kết hợp với nghiên cứu của Xie và cs. 2017 [21] sử dụng 106 mẫu vật với trình tự Cyt b với cặp mồi L14910 / H16064 cho rằng các mẫu vật B. multicinctus thu thập được tại các địa điểm có vị trí từ phía Tây Nam và Nam Trung Quốc bao gồm Vân Nam, Quý Châu, Phúc Kiến, Quảng Tây và Quảng Đông và loài Bungarus m. wanghaoti ở phía Tây Vân Nam là loài B. candidus. Nghiên cứu cũng cho rằng giới hạn cuối với loài B. multicinctus là ở phía Nam trong lãnh thổ của Trung Quốc và các mẫu vật được định danh là B. multicinctus
ở Việt Nam, Thái Lan, Myanmar là loài B. candidus.
Chính vì vậy, từ các dữ liệu hiện có chúng tôi đưa ra nhận định: Loài B. multicinctus không phân bố ở Việt Nam, các địa điểm trước đây ghi nhận loài
B. multicinctus ở Việt Nam loài B. candidus.
Nhóm A3 gồm các mẫu của loài B. multicinctus thu từ Đài Loan, Phúc Kiến, Quảng Tây và Hải Nam có sai khác di truyền tương đối tách biệt với các mẫu vật còn lại.
52
Hình 3.13. Cây quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Bungarus xây dựng trên mô hình BI
Phân tích được thực hiện trên 1x107 thế hệ. Lấy mẫu sau 1000 thế hệ - ln Likelihood đạt mức độ ổn định sau 16000 thế hệ. Chiều dài nhánh thể hiện khoảng cách di truyền giữa các taxon. Giá trị của gốc nhánh được coi là đạt độ tin cậy khi ≥ 95%). Các số hiệu phía sau tên loài là số đăng kí trên GenBank hoặc kí hiệu thực địa. (xem Bảng 3.3.)
53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Đã ghi nhận 04 loài thuộc giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam. Loài
B. slowinskii có tên trong Danh lục đỏ IUCN (2021) [77] bậc VU.
Bổ sung dữ liệu cập nhật các đặc điểm hình thái và phân bố của 3 loài thuộc giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt Nam, trong đó ghi nhận vùng phân bố mới của 03 loài gồm: B. candidus tại tỉnh Khánh Hòa và Quảng Ninh, B. fasciatus tại tỉnh Hà Giang. Xây dựng khóa phân loại đến loài trong giống
Bungarus tại Việt Nam gồm 04 loài với các đặc điểm hình thái rõ ràng.
Cung cấp thêm 08 trình tự đoạn gen COI của loài B. candidus và bổ sung lần đầu đoạn gen COI của loài B. slowinskii ở Việt Nam.
Về quan hệ di truyền, các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam nằm trên 3 phân nhánh A, B, C, D trong đó:
Phân nhánh A gồm các mẫu vật được xác định là B. candidus và B. multicinctus, giá trị xác suất hậu nghiệm gốc nhánh đạt gần tuyệt đối (98/100).
Phân nhánh A gồm 3 nhóm A1, A2, A3
Nhóm A1 và A2 được xác định là B. candidus
Nhóm A3 được xác định là B. multicinctus và B. “wanghaotingi”
nhưng không phân bố ở Việt Nam
Phân nhánh B gồm các mẫu vật được xác định là B. magnimaculatus và
B. suzhenae, giá trị xác suất hậu nghiệm gốc nhánh cao (87/100). Phân nhánh C gồm các mẫu vật được xác định là B. fasciatus
Phân nhánh D gồm các mẫu vật được xác định là B. slowinskii, giá trị xác suất hậu nghiệm gốc nhánh tuyệt đối
Từ các dữ liệu hình thái kết hơp với di truyền phân tử kết hợp với các nghiên cứu gần đây của Xie và cs. 2018 và Chen và cs. 2021 [21, 14], nghiên cứu khẳng định loài B. multicinctus và loài B. wanghaotingi không phân bố ở Việt Nam. Loài B. multicinctus ghi nhận trước đây ở Việt Nam được định loại là loài B. candidus. Kết quả nghiên cứu cũng khẳng định lại loài B.bungaroides
54
và loài B. wanghaotingi không phân bố ở Việt Nam.
2. Kiến nghị
Tiếp tục những nghiên cứu khác về các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam, tập trung vào các vấn đề sau:
Thu thập bổ sung mẫu vật để phân tích đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của các loài B. flaviceps ở ngoài tự nhiên và các loài khác trong giống để làm rõ hơn về mối quan hệ giữa các quần thể khác nhau trong cùng loài và khác loài trong giống.
Tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học sinh thái của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam để có thể phát triển thành công trong điều kiện nuôi nhốt nhằm hạn chế khai thác trực tiếp ngoài tự nhiên.