Thu nhận plasmid từ E. coli DH5
phương pháp SDS kiềm (Birnboim, Doly, 1979)
Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết trên gel agarose
43
Dòng hóa gen vào vector và giải trình tự gen
Cắt mở vòng plasmid bằng Enzyme cắt gới hạn (RE)
Tinh chế sản phẩm
Hóa biến nạp hỗn hợp dịch nối vào tế bào khả nạp E. coli DH5α
Trải hỗn hợp hóa biến nạp lên môi trường LB-Amp100 có bổ sung X-gal
Dòng hóa gen vào vector và giải trình tự gen
Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5
Dịch huyền phù tế bào eppendorf vô trùng, lạnh (khoảng 200µl/eppendorf) và giữ ở -20oC.
Cho 1ml dịch nuôi cấy trên vào 50ml môi trường LB lỏng, OD600 0,4- 0,6 (khoảng 3 giờ) 4oC trong 30 phút 10ml CaCl220mM và MgCl280mM CaCl2 0,1M lạnh và glycerol 20% lạnh
Dòng hóa gen vào vector và giải trình tự gen
Hóa biến nạp hỗn hợp dịch nối vào tế bào khả nạp E. coli DH5α
30 phút 2 phút 5 phút 1ml môi trường LB Ủ ở 37oC trong 0,5-1 giờ
Ly tâm thu sinh khối ở 10.000
Dòng hóa gen vào vector và giải trình tự gen
Hóa biến nạp hỗn hợp dịch nối vào tế bào khả nạp E. coli DH5α
Một số tế bào có thể có nhiều hơn một plasmid, một số có thể không có trong, và một số sẽ chỉ nhận được một plasmid duy nhất, mặc dù một số có thể bị ràng buộc với bề mặt tại thời điểm sốc nhiệt. Các plasmid Supercoiled được dễ dàng đưa lên, mang lại hiệu quả chuyển đổi trong khoảng 10 6 - 10 10biến thể / μg DNA
Tế bào được ủ trong môi trường ở 37oC để cho chúng hồi phục
Dòng hóa gen vào vector và giải trình tự gen
Dòng hóa gen vào vector và giải trình tự gen
Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi T3, T7, khuôn DNA là tế bào
E. coli DH5α từ khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trường LB-Amp100
51