Sử dụng phần mềm ChromasPro 2.1.10 nhằm kiểm tra chất lượng kết quả giải trình tự của các mẫu vật, với bốn nucleotide được thể hiện bằng bốn màu khác nhau: G–màu đen, T–màu đỏ, C–màu xanh dương, A–màu xanh lá (xem Hình 2.2). Sau đó hiệu chỉnh, loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu, thu nhận trình tự vùng gen CO1 đảm bảo có độ tin cậy cao, tiến hành đăng kí trình tự trên Genbank.
Hình 2.2. Bốn nucleotide được thể hiện bằng bốn màu khác nhau trên phần mềm ChromasPro 2.1.10.
Sử dụng BLAST để tìm kiếm trên GenBank mẫu vật của các loài có trình tự vùng gen CO1 tương đồng hoặc gần tương đồng với các loài nghiên cứu nhằm hỗ trợ việc định danh mẫu vật bằng nguồn gen. Sau đó, lựa chọn mẫu vật của các loài có hình thái tương tự và/hoặc có vùng phân bố gần với loài nghiên
cứu. Kiểm tra lại mẫu vật trên BOLD, đảm bảo mẫu được lựa chọn có trình tự vùng gen CO1 độ dài lớn hơn 500 bp, phù hợp với mẫu nghiên cứu. Có 45 mẫu đã được chọn lọc từ BOLD, trong đó mẫu MT080189 của loài Acherontia lachesis được lựa chọn làm nhóm ngoài (xem Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Danh sách các mẫu được lựa chọn trên BOLD có trình tự vùng gen CO1 tương ứng với mẫu nghiên cứu.
Stt Loài / Loài phụ Mã số Độ dài (bp)
Quốc gia 1 Carterocephalus alcina MW115558 658 Việt Nam 2 Carterocephalus palaemon MW115571 658 Nhật Bản 3 Carterocephalus
longimaculatus MW115563 658 Trung Quốc 4 Sebastonyma medoensis MN199421 658 Trung Quốc 5 Catochrysops panormus HQ570943 658 Papua New Guinea 6 Catochrysops strabo MN727354 658 Trung Quốc 7 Cigaritis syama MT124684 658 Đài Loan 8 Cigaritis acamas MW503431 658 Cộng hòa Síp 9 Spindasis vulcanus HQ990428 658 Pakistan 10 Spindasis lohita KT236354 658 - 11 Curetis bulis stigmata KF491662 658 Malaysia 12 Curetis saronis sumatrana KF226370 658 Malaysia 13 Curetis barsine HQ570708 658 Papua New Guinea 14 Dilipa morgiana AB501204 543 -
15 Dilipa fenestra EF534094 657 Trung Quốc 16 Dilipa fenestra MW318398 658 - 17 Symbrenthia lilaea EU368155 657 - 18 Symbrenthia lilaea KJ649017 658 Việt Nam 19 Symbrenthia hippoclus MW318646 658 - 20 Symbrenthia platena MW318650 658 - 21 Symbrenthia hypselis KF226627 658 Malaysia 22 Vanessa indica KC158467 658 Pakistan 23 Vanessa indica KJ649019 604 Việt Nam 24 Vanessa indica KJ649020 604 Việt Nam
25 Vanessa vulcania KJ648986 658 Tây Ban Nha 26 Vanessa annabella KJ648975 658 Mỹ 27 Colias fieldii HQ990336 658 Pakistan 28 Colias montium HE775185 658 Trung Quốc 29 Colias interior GU690369 658 Canada 30 Colias palaeno MN140559 658 Áo 31 Colias phicomone MW503017 658 Ý 32 Gonepteryx amintha EF584864 617 Trung Quốc 33 Gonepteryx rhamni KC461234 658 - 34 Gonepteryx maxima KF491764 658 Nhật Bản 35 Gonepteryx farinosa MW502933 658 Hy Lạp
36 Pieris canidia MF973398 658 -
37 Pieris mannii GU676312 658 Tây Ban Nha 38 Pieris rapae MW501927 658 Ba Lan 39 Pieris brassicae MW136481 658 Ấn Độ 40 Dodona eugenes venox KX866727 658 - 41 Dodona eugenes eugenes KX866711 658 -
42 Dodona ouida KX866691 658 -
43 Dodona adonira KX866730 658 -
44 Dodona elvira KX866692 658 -
45 Acherontia lachesis MT080189 658 -
Sử dụng phần mềm MEGA X [51] để sắp xếp thẳng hàng, so sánh các trình tự bằng ClustalW và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Tiết kiệm tối đa (Maximum parsimony – MP) dựa vào nhóm đối chứng (nhóm ngoài – outgroup), với giá trị bootstrap 1.000 lần lặp lại. Phương pháp MP sử dụng nguyên lý suy luận dựa trên ít nhất những biến đổi (đột biến hiếm khi xảy ra), với giả định rằng cây tiến hóa phù hợp nhất là cây mô tả được các lòai ít thay đổi nhất, tức là có ít đột biến nhất trong quá trình tiến hóa. Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ tính toán nhanh và được cho là khách quan nhất. Trong phương pháp MP dành cho cây không có gốc, tất cả bazơ tại tất cả vị trí được xem là có tốc độ tiến hóa như nhau. Nhánh có giá trị bootstrap (ở gốc nhánh) từ 70% trở lên được xem là đáng tin cậy trong phân tích phát sinh loài [52].
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN