Phương pháp xác định cấu trúc

2.2.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR)

Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích cấu trúc các ionic polysaccharide nói riêng. Phương pháp này cung cấp những thông tin về cấu trúc quan trọng để xác định kiểu nhóm chức trong phân tử polysaccharide.

Bảng 2.1. Một số nhóm đặc trưng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR của polysaccharide

Phổ FT-IR đã được áp dụng thành công để phân tích các polysaccharide như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển. Bảng 2.1 đưa ra các nhóm đặc trưng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR của polysaccharide.

Trong thí nghiệm này, mẫu TSP và dẫn xuất TSPS được ép viên với KBr theo tỷ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR được đo trên máy Nicolet iS50 FTIR (Thermo Scientific) trong vùng dải sóng 4000-400 cm-1.

2.2.3.2. Phương pháp phổ NMR

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide. Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide thì phổ 1H và 13C-NMR thường được sử dụng. Trong một số trường hợp phổ 1H-NMR còn dùng để định lượng polysaccharide có trong mẫu phân tích Phổ NMR được thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Đặc trưng phổ 1H- NMR và 13C-NMR của glucan được thể hiện trong Hình 2.1. Trong phổ 1H- NMR tất cả độ dịch chuyển hóa học của carbohydrate bao gồm mono-, oligo-, và polysaccharide có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6 ppm trong chất nội chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học proton anomer của mỗi monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình  hay . Ví dụ như với protonanomer sẽ xuất hiện tại δ 5–6 ppm trong khi đó với proton - anomer là tại vùng δ 4–5 ppm. Phổ 13C-NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng có những lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharide vì độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR được trải rộng trên thang đo (Hình 2.1). Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13C-NMR đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1H-NMR. Trên phổ 13C- NMR các tín hiệu carbon anomer xuất hiện tại vùng δ 90–110 ppm trong khi đó các tín hiệu của carbon không ở vị trí anomer xuất hiện tại δ 60 và 85 ppm. Với polysaccharide có nhóm deoxy như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (15–20 ppm). Với hai loại proton anomer, tín hiệu của carbon-anomer xuất hiện tại δ 95–100 ppm trong khi đó tín hiệu của hầu hết carbon-anomer xuất hiện tại δ 100-105 ppm. Với polysaccharide có chứa nhóm acid uronic, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170–180 ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60–64 ppm), trong khi đó độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranose và C2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 65–85 ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển về phía

trường yếu 5–10 ppm. Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharide chưa xác định ngay được cấu trúc mà cần được so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để hoàn thiện cấu trúc dùng phổ 2D-NMR và một số kỹ thuật khác. Phổ 1H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharide. Tuy nhiên, có sự xuất hiện hiện tượng chồng chéo của các tín hiệu proton trong quá trình định lượng polysaccharide. Do vậy phổ 13C-NMR với kỹ thuật đo đặc biệt cũng có thể dùng để định lượng polysaccharide vì các tín hiệu của carbon anomer được tách riêng trong phổ. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid).

Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4 đến 5,8 ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của tín hiệu các cộng hưởng proton anomer ta cũng có thể đánh giá tỷ lệ của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR. Nhìn chung, kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hoá học.

Hình 2.1. Phổ NMR của -D-glucan. a) Phổ 1H-NMR của (13) và (14)

-D-glucan; b) Phổ 13C-NMR của (13) và (14) -D-glucan

Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC. Từ các thông số độ chuyển dịch hóa học của C1, H1 thông qua phổ tương tác dị hạt nhân 1H – 13C HSQC có thể đưa ra được cấu trúc hóa học cơ bản của monosaccharide (Bảng 2.2).

Bảng 2.2. Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu sugabase của dạng glucose,galactose và xylose dung môi D2O

Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học của các monomer không thế. Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hoá. Trật tự các monomer trong mạch polysaccaride được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ HMBC và NOESY.

Trong thí nghiệm ở đây, việc chuẩn bị mẫu được thực hiện bằng cách hòa tan 5 mg polysaccharide tinh khiết đông khô trong 600 μL nước deuterium (D2O). Dung dịch được khuấy trong 2 giờ ở 40°C và sau đó đông khô. Quá trình này được lặp lại hai lần. Phổ 1H NMR của TSP và TSPS trong D2O được ghi lại trên máy đo phổ Bruker Avance 500 MHz (Bruker Biospin, Đức) sử dụng TMS (tetramethyl silane) làm chất nội chuẩn. Sự thay đổi hóa

học được biểu thị bằng ppm. Phân tích được thực hiện tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3.3. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký để phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột. GPC có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lượng trung bình Mw, trọng lượng phân tử trung bình số Mn, và đặc trưng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lượng phân tử của nó. GPC được sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polymertổng hợp hay các polymertự nhiên như polysaccharide. Ngoài việc cung cấp thông tin về sự phân bố trọng lượng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành các thành phần của nó như polymer, oligomer, monomer, và các chất phụ gia. Sơ đồ khối tổng quát của thiết bị GPC được đưa ra trên sơ đồ hình 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ khối tổng quát của thiết bị GPC

Trọng lượng phân tử trung bình của dẫn xuất TSP được xác định bằng hệ thống sắc ký GPC P100 (Aligent technologies, Hoa Kỳ) với dòng chảy duy trì 1mL/phút, pha động là NaNO3 0.1N, sử dụng detector RI, cột đo TSK G3000-PW, nồng độ mẫu TSP là 0.001 mg/mL, nhiệt độ là 30oC. Các dữ liệu

được xử lý bằng phần mềm Jiangshen Workstation. Phân tích được thực hiện tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.4. Phương pháp xác định hình thái bề mặt TSP dưới kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM)