2.3.3.1. Xây dựng đường chuẩn
Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính.
Xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết bằng cách chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn. Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có đường biểu diễn là một phương trình có dạng: y = ax + b.
Trong đó: a là giá trị slope (độ dốc)
b là giá trị intercept (hệ số chặn) và hệ số tương quan R. 1 , 2 2 1 1 ( ).( ) ( ) . ( ) n i i i x y n n i i i j x X y Y R x X y Y
2.3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của
chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. Có nhiều cách để xác định LOD, nhưng trong sắc kí hay sử dụng cách thêm chuẩn nồng độ thấp vào nền mẫu trắng đến khi thu được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N xấp xỉ 3 (nằm trong khoảng từ 2 đến 4).
Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. Có thể xác định LOQ từ LOD thông qua mối quan hệ LOQ = 3,3xLOD.
2.3.3.3. Độ chính xác (độ chụm và độ đúng)
Độ chụm: Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau. Điều này do các sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, khó kiểm soát được các sai số này, nên phải dùng đến khái niệm độ chụm. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình. Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên càng lớn.
Cách xác định: Tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau. Phân tích các mẫu thêm chuẩn đó (mỗi mức phân tích lặp lại 7 lần, mỗi lần bắt đầu từ cân). Tính độ lệch chuẩn SD hay hệ số biến thiên CV theo công thức:
% % SD 100 RSD CV x X Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm i
x : Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”
RSD %: Độ lệch chuẩn tương đối CV%: Hệ số biến thiên
Độ đúng của phương pháp: Là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị đúng). Độ đúng là khái niệm định tính và được biểu diễn định lượng dưới dạng độ chệch (Bias) hoặc hiệu suất thu hồi (recovery).
Xác định hiệu suất thu hồi: Tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau. Phân tích các mẫu thêm chuẩn đó (mỗi mức phân tích lặp lại 7 lần). Tính hiệu suất thu hồi đối với mẫu trắng theo công thức: % tt 100 c C H x C Trong đó:
H%: Hiệu suất thu hồi, %
Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Cc: Nồng độ thêm chuẩn (lý thuyết)
Sau đó tính hiệu suất thu hồi chung là trung bình của hiệu suất thu hồi các lần phân tích lặp lại.
Khi xác định hiệu suất thu hồi, thường thêm chuẩn ở ba mức nồng độ là mức thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc.
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) tính theo diện tích pic sắc kí của 03 lần thực hiện riêng biệt trên cùng một nồng độ phải nhỏ hơn 10 %.
Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm được tính theo công thức chung như sau:
0 1 ( ) C x X m V
Trong đó:
X: nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm, μg/kg hoặc μg/L C0: nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, μg/L
1: Thể tích định mức 1 mL, (mL)
m: khối lượng mẫu phân tích, (g) hoặc (V) thể tích mẫu phân tích, (mL)