2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn tía quang hợp
Các bước tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo mô tả trong nghiên cứu trước đây [125]. Cụ thể, 1 mL dịch nuôi cấy được ly tâm trong ống eppendorf để thu lấy phần sinh khối, sau đó rửa tế bào 2 lần bằng đệm natriphosphate (pH 8): bổ sung 300 μl NaPP, votex cho tan sinh khối và ly tâm ở 6500 v/ph trong 10 phút. Bỏ phần dịch nổi. Bổ sung 540 μl đệm tách (Tris-C1 1 M; EDTA 0,5 M; NaPP 1 M; NaCl; CTAB 1%), votex kỹ. Bổ sung 20 μl protease K (20 mg/ml), lắc ở 37oC trong 1 giờ đến 1 giờ 30 phút. Bổ sung 60 μl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 2 giờ. Protein được loại bỏ bằng một thể tích CI (Chloroform:Isopropanol) 24:1 (v/v), đảo nhẹ và ly tâm 12000 v/ph trong 15 phút. DNA được tủa bằng một lần thể tích isopropanol ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ly tâm 12000 v/ph trong 15 phút ở 4oC, phần tủa là DNA genome được thu lại. Rửa tủa bằng 500 μl ethanol 70% (lạnh). Ly tâm 12.000 v/ph trong 10 phút ở 4oC, bỏ dịch. Tủa được làm khô bằng máy hút chân không. Tủa được hòa bằng nước deion khử trùng đã loại DNase với thể tích khoảng 25-30 μl.
2.2.2.2. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn 16S rRNA [125]. Cụ thể, các thành phần tham gia phản ứng PCR (25 μl) bao gồm 12,5 μl MasterMix 2X, 1,0 μl mồi 27f 10 mM, 1,0 μl mồi 1527r 10 mM, 2,0 μl DNA khuôn và 8,5 μl nước deion đã loại DNase. Chu trình nhiệt để tiến hành phản ứng PCR nhân gen 16S rRNA: 95oC - 5 phút, 30 chu kỳ của (95oC - 50 giây, 58oC - 45 giây, 72oC - 1 phút 30 giây), 72oC - 8 phút, 4oC - ∞.
Trình tự nucleotide của sản phẩm PCR được xác định bằng hệ thống đọc trình tự DNA tự động ABI (Mỹ) và được phân tích bằng phần mềm tin sinh Bioedit, Clustal X và Mega4.
2.2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Điện di DNA trên gel agarose được tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russel (2001). Gel agarose 1% được chuẩn bị, mẫu DNA được trộn với 2 µl loading dye và tra vào các giếng nhỏ và tra chỉ thị phân tử DNA chuẩn để xác định kích thước phân tử của mẫu DNA trên bản gel. Chạy diện di với điện thế
100V trong 35 phút. Sau khi kết thúc quá trình điện di, đưa bản gel vào nhuộm trong Ethidium Bromide trong 5 phút, bản gel được rửa lại bằng nước và mang đi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA và chụp ảnh [135].