Các kết quả, số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học. Dựa vào phần mềm Excel để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tính trung bình mẫu. Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là p<0,05.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng CNSH môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ
3.1.1. Kết quả phân lập VKTQH từ các mẫu nước và bùn ô nhiễm dầu
Để phân lập các chủng VKTQH tiềm năng có khả năng phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ, các mẫu nước và bùn đã được thu thập tại các vùng biển Việt Nam. Các mẫu được làm giàu trong môi trường DSMZ 27 có bổ sung dầu diesel hoặc naphthalene, pyrene và anthracene. Sau đó, các bình nuôi VK được giữ trong điều kiện kỵ khí, ánh sáng tương đương 5000 Lux, nhiệt độ 30±2oC (Hình 3.1).
Theo dõi sau 5 - 7 ngày, màu sắc của môi trường làm giàu chuyển đổi rõ rệt sang màu đỏ tía, trên thành bình cũng quan sát có xuất hiện của các vệt màu. Kết quả này cho thấy có sự biểu hiện của VKTQH, thể hiện ở sắc tố quang hợp đặc trưng. Như vậy, dịch huyền phù trên các bình làm giàu được thu lại để tiến hành thí nghiệm phân lập các chủng VKTQH.
Hình 3.1. Mẫu bùn ô nhiễm dầu trước và sau làm giàu Trước Sau
Tiếp theo, các dịch làm giàu đã pha loãng được cấy trên môi trường thạch DSMZ 27 có bổ sung hydrocarbon dầu mỏ (toluene/pyrene/naphthalene/dầu diesel/ phenol/anthracene), tổng số 15 khuẩn lạc VKTQH đã bước đầu được tách riêng, làm thuần trên các môi trường thạch (Hình 3.2, Bảng 3.1). Trong đó, Hình 3.2 minh họa sự phát triển khuẩn lạc của chủng VKTQH được làm giàu từ mẫu nước bị ô nhiễm dầu mỏ, trong khi Bảng 3.1 mô tả hình thái các khuẩn lạc VKTQH đã phân lập trong luận án này.
Hình 3.2. Một số khuẩn lạc VKTQH được phân lập từ mẫu làm giàu
Kết quả từ Bảng 3.1 cho thấy tại 15 khuẩn lạc VKTQH phân lập được tại vị trí ô nhiễm khác nhau có màu sắc, kích thước và hình dáng khuẩn lạc khác nhau và rất đa dạng. Màu sắc khuẩn lạc của chúng chủ yếu là từ đỏ nhạt đỏ tía đến đỏ đậm, từ nâu nhạt đến nâu đậm, vàng nhạt đến vàng đậm. Tại vùng biển Quảng Ngãi phân lập được nhiều chủng vi khuẩn nhất (8 chủng), vùng biển Vũng Tàu phân lập được ít chủng vi khuẩn nhất (2 chủng), Nha Trang - Khánh Hòa lập được 5 chủng (Cảng cầu đá 3 chủng và Làng chài 2 chủng). Trên nguồn cơ chất toluene phân lập được nhiều chủng nhất (4 chủng); tiếp theo trên pyrene phân lập được 3 chủng; trên napthalene, dầu diesel, phenol, anthracene mỗi nguồn cơ chất phân lập được 2 chủng. Toàn bộ 15 chủng VKTQH đã phân lập được tiếp tục được lưu giữ trong glycerol 20% ở điều kiện -20oC để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập các khuẩn lạc VKTQH từ nguồn mẫu nước bị ô nhiễm dầu mỏ ở các vùng biển Việt Nam
STT Ký hiệu
khuẩn lạc
Hình ảnh khuẩn lạc Hình thái, màu sắc,
kích thước khuẩn lạc Nguồn cơ chất Nguồn phân lập 1. DQ41 (DD4)
Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, có rìa trong, không nhân, màu đỏ đậm, đường kính 1 - 1,5mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
2. DQ42
Khuẩn lạc tròn, lồi, rìa trong, loang, màu tím tía, đường kính 1mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
3. DQ51
Khuẩn lạc tròn, trơn, bóng, có rìa phẳng, màu đỏ tía, đường kính 0,5 mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
4. DQ52
Khuẩn lạc tròn, trơn, bóng, có rìa trong, màu đỏ tía, đường kính < 0.5mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
5. DQ81
Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn bóng, rìa trong và phẳng, có nhân, màu đỏ
đậm, đường kính 2 - 2,5 mm Napthalene
Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
6. DQ82
Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, có nhân, có chân, màu đỏ gạch, đường kính 1,5 mm
Napthalene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
7. FO1 Khuẩn lạc tròn, lồi, trơn, bóng, rìa loang, đỏ tía, đường kính 1 mm
Dầu diesel Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Vũng Tàu
8. FO2 Khuẩn lạc tròn, trơn, rìa loang, đỏ
nhạt, đường kính < 0,5 mm
Dầu diesel Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Vũng Tàu
STT Ký hiệu khuẩn lạc
Hình ảnh khuẩn lạc Hình thái, màu sắc,
kích thước khuẩn lạc
Nguồn cơ chất
Nguồn phân lập
9. DD3 Khuẩn lạc tròn, bóng, rìa trong, có nhân, đỏ nhạt, đường kính 1 mm
Phenol Mẫu bùn nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
10. DD4 Khuẩn lạc tròn, nhỏ li ti, màu đỏ nhạt
Phenol Mẫu bùn nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
11. PY2
Khuẩn lạc có nhân, lồi, tròn, bề mặt bóng, màu nâu vàng, đường kính 0.8-1.2 mm.
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hòa
12. PY6
Khuẩn lạc có nhân màu nâu đậm hơn, mép loang, màu nâu vàng, đường kính 1.5 mm.
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hòa
13. PY9
Khuẩn lạc màu hồng nhạt, có nhân, rìa trong, đường kính 1-2 mm.
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hòa
14. LC1
Khuẩn lạc tròn, lồi, trơn, bóng, màu đỏ nhạt, rìa trong, đường kính 2-2.5 mm.
Anthracene Làng chài Nha Trang – Khánh Hòa
15. LC5
Khuẩn lạc hồng nhạt, có nhân màu đỏ, nhớt, có rìa, đường kính 5 mm.
Anthracene Làng chài Nha Trang – Khánh Hòa
3.1.2. Tuyển chọn các chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ
3.1.2.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Các chủng VKTQH sau khi được phân lập và làm sạch cùng 17 chủng VKTQH trong bộ sưu tập được tuyển chọn theo phương pháp 2.2.1.4 chương 2 được nuôi trong môi trường DSMZ 27 để đánh giá khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học. Bảng 3.2 trình bày kết quả xác định khả năng sinh trưởng của 32 chủng VKTQH phân lập được sau 7 ngày nuôi cấy:
Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng của các chủng VKTQH
STT Ký hiệu chủng ∆OD800 1. FO2 1.291±0.01 2. DQ52 1.283±0.012 3. DQ41 (DD4) 1.257±0.01 4. DQ42 1.25±0.02 5. DD3 1.228±0.03 6. DD4 1.222±0.01 7. DQ51 1.21±0.02 8. DQ82 1.19±0.012 9. FO1 1.163±0.01 10. DQ81 1.162±0.018 11. DG211 0.99±0.06 12. QP21 0.99±0.02 13. DG217 0.98±0.01 14. DG114 0.97±0.038 15. DG12 0.97±0.024
STT Ký hiệu chủng ∆OD800 16. PY6 0.97±0.023 17. LACM2I2 0.96±0.01 18. NMS412 0.95±0.023 19. A3II3 0.94±0.026 20. PY2 0.93±0.03 21. DG218 0.91±0.05 22. LC1 0.90±0.01 23. MI1 0.87±0.04 24. DG213 0.84±0.018 25. NMS25 0.82±0.02 26. VH 0.82±0.01 27. LC5 0.78±0.03 28. DG214 0.77±0.011 29. NMS411 0.76±0.01 30. PY9 0.74±0.01 31. HQP304 0.73±0.03 32. LACM1 0.71±0.01
Kết quả cho thấy, tất cả 32 chủng VKTQH đều sinh trưởng tốt trên môi trường DSMZ 27, trong đó có 10 chủng có kí hiệu là FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 sinh trưởng tốt nhất (∆OD800>1).
Song song với thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng của 32 chủng VKTQH chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng tạo màng sinh học.
Hình 3.3. Khả năng tạo màng sinh học dựa trên khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do các chủng VKTQH tạo thành
Hình 3.4. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng VKTQH phân hủy hydrocarbon dầu mỏ và Acinetobacter calcoaceticus P23 (K: đối chứng âm)
Kết quả tạo màng sinh học của 32 chủng VKTQH được so sánh với chủng chủng P23 là đối chứng dương [124] cho thấy 10 chủng là FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 tạo màng sinh học tốt hơn so với chủng P23 là đối chứng dương có giá trị OD600 đạt 17,6 (Hình 3.3 và 3.4). Trong đó, bốn chủng VKTQH, bao gồm DQ41, DQ51, DD4 và DQ82 có khả năng hình thành màng sinh học mạnh, giá trị OD600 từ 20,6 đến 22,4 và tiếp tục tăng sau 7 ngày nuôi cấy (Hình 3.3 và Hình 3.4). Do đó, chúng tôi lựa chọn 10 chủng này để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.2. Khả năng sử dụng hydrocarbon dầu mỏ của các chủng vi khuẩn tía quang
hợp
Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng trên các nguồn hydrocarbon dầu mỏ của 10 chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học tốt. Cụ thể, thí nghiệm
được thực hiện bằng cách thay thế acetate trong thành phần của môi trường DSMZ 27 bằng các cơ chất khác nhau, bao gồm dầu diesel, toluene, naphthalene, phenol và pyrene.
(i) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên dầu diesel
Kết quả cho thấy cả 10 chủng VKTQH đều ghi nhận có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có bổ sung cơ chất dầu diesel nồng độ 4 – 8% (Hình 3.5, Hình 3.6), đáng chú ý nhất là 3 chủng DQ41, FO2 và DD4.
Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ dầu diesel khác nhau
Hình 3.6. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 10 % dầu diesel sau 7 ngày Cụ thể, dựa vào màu sắc dịch huyền phù và đo độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 800 nm, các chủng VKTQH đã được lựa chọn đều có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa dầu diesel với nồng độ từ 4 - 10% (v/v), tốt nhất trong khoảng 4 - 8% (v/v), chậm sinh trưởng ở nồng độ dầu 9 ÷ 10%.
(ii) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên toluene
Toluene là một thành viên trong nhóm chất BTEX (gồm benzene, toluene, ethylbenzene và xylene), là nhóm chất ô nhiễm phổ biến trong các khí thải công nghiệp, nước thải của các nhà máy keo, dung môi, thuốc nhuộm [57]. Khả năng sử dụng toluene cũng được xem là một trong những tiêu chí quan trọng khi nghiên cứu về đặc tính của 10 chủng VKTQH trong luận án này.
Dựa vào độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào nuôi trong môi trường có bổ sung toluene ở các nồng độ khác nhau trong 7 ngày đo ở bước sóng 800 nm (Hình 3.7) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.8), chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 150 ppm chủng FO2 và DQ52 phát triển mạnh nhất (∆OD800 > 1), ở nồng độ 200 ppm chủng DQ41, DD4, DQ52 và FO2 sinh trưởng mạnh (∆OD800 > 1), ở nồng độ 250 ppm chủng DQ41, FO2 và DD4 sinh trưởng mạnh (∆OD800 > 1), đến nồng độ 300 ppm OD sinh trưởng của cả 10 chủng đều bị giảm, đặc biệt là 3 chủng DQ52, DQ81 và DD82 (∆OD800 < 0,8). Ba chủng DQ41, FO2 và DD4 vẫn có thể sinh trưởng khá tốt (0.9 <∆OD800 <1,0).
Hình 3.7. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ toluene khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy
trên giá thể sỏi nhẹ, xơ dừa và mút xốp cao nhất được xác định tương ứng là 13, 20 và 12 nm. Theo công bố của Levison và cộng sự (1994), chất nền và oxy có thể dễ dàng khuếch tán cho các hoạt động trao đổi chất trong màng sinh học có độ dày từ 10–20 mm [152]. Hơn nữa, số lượng VKTQH được gắn trên xơ dừa cao hơn so với sỏi nhẹ và mút xốp (Hình 3.2). Như vậy có thể kết luận xơ dừa là giá thể phù hợp nhất cho VKTQH bám dính.
Cấu trúc giá thể cho phép tăng bề mặt tương tác giữa cơ chất, vi khuẩn và môi trường nước, dẫn đến tăng hiệu suất phân hủy. Một số nghiên cứu trước đây đã đưa ra giả thuyết về cơ chế hấp phụ và phân huỷ dầu diesel trên màng sinh học. Cụ thể: trong giai đoạn đầu tiên các giá thể hấp phụ nhanh dầu diesel và làm giảm đáng kể nồng độ dầu. Giai đoạn thứ hai là quy trình xử lý sinh học trong đó vi khuẩn sử dụng hydrocarbon dầu mỏ làm nguồn carbon để giảm các thành phần dầu trong nước. Cuối cùng, dầu diesel bị VK phân huỷ thành CO2 và H2O [153, 154].
3.4.2.3. Hiệu suất phân hủy dầu diesel của màng sinh học
Màng sinh học đơn chủng và màng sinh học đa chủng VKTQH hình thành trên các giá thể khác nhau hoặc không có giá thể được đánh giá về hiệu suất phân hủy dầu diesel. Đối chứng là mô hình thí nghiệm chỉ có giá thể, không có VKTQH. Dầu diesel được bổ sung vào thí nghiệm với nồng độ ban đầu 17,2 g/l. Hiệu quả phân hủy được đánh giá sau 14 ngày nuôi cấy qua phân tích trọng lượng dầu còn lại.
Kết quả phân tích (Hình 3.25a) cho thấy khi không có giá thể màng sinh học tạo ra bởi từng chủng DD4, DQ41 và FO2 đã phân hủy dầu diesel với hiệu suất lần lượt là 56, 60 và 58%, màng sinh học đa chủng đạt 78%.
Sự gia tăng số lượng tế bào VKTQH được quan sát rõ sau 5 ngày nuôi cấy, phù hợp với hiệu suất phân hủy tăng sau 5 ngày nuôi cấy. Sau 9 ngày, số lượng tế bào có xu hướng giảm, tương ứng với hiệu suất phân hủy đi xuống, nguyên nhân do lượng cơ chất đã cạn kiệt. Từ kết quả thu được, có thể suy ra rằng để sản xuất sinh khối, các tế bào đòi hỏi phải khai thác dầu diesel làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.25. Đồ thị biểu thị thời gian phân hủy dầu diesel và mật độ tế bào của chủng VKTQH trong màng sinh học đơn hoặc đa chủng không giá thể.
Chú thích: (a), DD4; (b), DQ41 (c), FO2 và (d), MSH đa chủng không gắn giá thể .
Sau 14 ngày nuôi cấy với nồng độ ban đầu 17,2 g/l, hiệu suất phân hủy dầu diesel bởi màng sinh học đa chủng VKTQH trên giá thể (sỏi nhẹ, mút xốp và xơ dừa) (Hình 3.26) không khác biệt lớn. Ba loại giá thể sỏi nhẹ, mút xốp và xơ dừa hấp phụ một lượng nhỏ dầu diesel, tương ứng là 16, 12 và 15%. Trong khi đó, màng sinh học đa chủng được hình thành trên giá thể sỏi nhẹ, mút xốp và xơ dừa phân hủy dầu diesel ở mức cao lần lượt là 90, 91 và 95% (p <0,05).
Hình 3.26. Khả năng phân hủy dầu diesel và mật độ tế bào của chủng VKTQH DD4, DQ41 và FO2 trong MSH đa chủng trên giá thể.
(a), MSH trên sỏi nhẹ; (b), MSH trên xơ dừa; (c), MSH trên mút xốp a
b
Kết quả (Hình 3.25 và Hình 3.26) chỉ ra rằng màng sinh học tạo thành bởi VKTQH trên giá thể có hiệu suất phân hủy dầu diesel > 90%, đặc biệt là màng sinh học trên xơ dừa 95% (p <0,05), cao hơn rất nhiều so với màng sinh học không tạo trên giá thể (56 – 78%).
Trong nghiên cứu của chúng tôi, thành phần chính của dầu diesel là n-alkane có số lượng carbon từ 8 đến 16. Do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu suất phân hủy các n-alkane khác nhau trong dầu diesel (đối chứng là giá thể xơ dừa không có VKTQH và màng sinh học đa chủng không gắn giá thể).
Hiệu suất phân hủy các thành phần n-alkane trong dầu diesel bởi màng sinh học đa chủng VKTQH sau 14 ngày được thể hiện trên Hình 3.27.
Hình 3.27. Hiệu suất phân hủy thành phần n-alkane (từ C8 đến C16) có trong dầu diesel bởi màng sinh học đa chủng VKTQH trên các giá thể sau 14 ngày nuôi cấy
(Đối chứng: xơ dừa không có VKTQH và MSH đa chủng không giá thể)
Các kết quả thu được cho thấy giá thể chỉ có thể hấp phụ một phần nhỏ n- alkane, hiệu suất phân hủy bởi màng sinh học trên giá thể cao hơn hẳn so với màng sinh học đa chủng không gắn giá thể, cụ thể: hơn 77% thành phần hydrocarbon đã bị phân hủy bởi màng sinh học đa chủng trên ba loại giá thể, cao nhất là hiệu suất
phân hủy n-alkane của màng sinh học trên xơ dừa dao động từ 80 đến 94%, trong khi màng sinh học trên sỏi nhẹ và mút xốp hiệu suất phân hủy thấp hơn và không có sự khác biệt lớn (p> 0,05). Từ các kết quả thu được cho thấy xơ dừa là giá thể tốt nhất để loại bỏ dầu diesel.
Những kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây chứng minh rằng vi khuẩn cố định trên giá thể tăng cường loại bỏ dầu diesel [122, 153, 154]. Sự hình thành màng sinh học trên giá thể có thể bảo vệ các tế bào chống lại các điều kiện môi trường khắc nghiệt và các chất ô nhiễm độc hại [107, 122].
Chen và cộng sự (2020) khi nghiên cứu khả năng phân huỷ các n-alkane