7. 2 Nội dung nghiên cứu
7.4.4. Phân lập và tách dòng gen OsDREB1F liên quan đến khả năng
Qua nghiên cứu về đặc điểm nông học ở thế hệ R2, đặc điểm hoá sinh và khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở thể hệ R3 chúng tôi đã chọn ra ở giống lúa Xuân Châu Hương hai dòng là R3.13 và R3.44 có những đặc điểm nổi bật hơn cả (thời gian sinh trưởng ngắn, chiều dài bông tăng, số nhánh hữu hiệu/khóm, số hạt chắc trên bông, khối lượng 1000 hạt và năng suất cao hơn so với đối chứng và các dòng khác), để tiến hành phân lập và tách dòng gen liên quan đến khả năng chịu lạnh của cây.
7.4.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của dòng chọn lọc R3.13 và R3.44 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh
DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Chất lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm. Tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số của hai dòng lúa nước là R3.13 và R3.44 có nguồn gốc từ giống XCH theo phương pháp của Foolad và cs (1995) [41].. Sau khi tách DNA tổng số, tôi tiến hành kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA tổng số bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản gel trong ethydium bromide và soi dưới ánh đèn cực tím cho thấy mẫu DNA thu được có chất lượng tốt, DNA tập trung một băng chính và không bị đứt gãy (hình 3.4). Đo OD 260nm và 280nm, chúng tôi đã xác định được hàm lượng DNA trong dung dịch của R3.13 là 115,3µg/ml và R3.44 là 145,62µg/ml. Như vậy chất lượng và hàm lượng của 2 dòng lúa này đủ điều kiện để thực hiện các phản ứng tiếp theo.
Hình 3.4. Kết quả tách chiết DNA tổng số của 2 mẫu lúa M: marker; 1: R3.13; 2: R3.44
36
7.4.4.2. Nhân gen OsDREB1F bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để nhân gen OsDREB1F với cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự DNA phân lập từ lúa được công bố bởi Qiuyun Wang và cs (2008), có mã số trên GenBank là AY785897 [48]. Gen OsDREB1Fcó chiều dài 660 bp mã hóa cho phân tử protein gồm 219 axit amin với khối lượng phân tử là 23,8 kDa.Trên cơ sở xác định được nồng độ DNA khuôn tối ưu cho phản ứng PCR, tôi đã tiến hành nhân gen OsDREB1F của 2 dòng lúa có khả năng chịu lạnh tốt nhất là R3.13 và R3.44 có nguồn gốc từ XCH.
Phản ứng PCR để nhân gen được thực hiện trên máy PCR với cặp mồi đặc hiệu là DREB1F và DREB1R. Nhiệt độ gắn mồi là 54oC, kích thước đoạn gen cần nhân ước tính khoảng 570bp. Kết quả nhân gen được thể hiện trên hình 3.5
M 1 2
570 bp
Hình 3.5. Kết quả nhân gen osDREB1F của 2 mẫu lúa M: marker; 1: R3.13; 2: R3.44
Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen DREB1F trên hình 3.5 cho thấy, ở mẫu nghiên cứu xuất hiện phân đoạn DNA đặc hiệu có kích thước gần đúng theo tính toán lý thuyết là khoảng 570bp, hàm lượng của sản phẩm đủ lớn để sử dụng cho việc tách dòng gen.Tiến hành tinh sạch các phân đoạn DNA này theo bộ Kit của hãng Bioneer ( AccuPrep PCRPurification Kit) để thu nhận đoạn gen mong muốn trước khi biến nạp để chuẩn bị cho bước tách dòng gen.
37
7.4.4.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và chọn dòng plasmit tái tổ hợp mang gen osDREB1F
Gen quan tâm sau khi được nhân lên nhờ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và được tinh sạch sẽ được nối vào vector tách dòng pBT. Trình tự của gen quan tâm sẽ được nối vào vị trí MCS (multiple conoling site) ở trên trình tự của gen GUS có trên pBT.
Sau đó vector pBT sẽ được biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG. Sau đó các tế bào này sẽ được nuôi ở 370C trong 16 giờ.
Hình 3.6. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Khi có các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc được trên môi trường chọn lọc chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Trong đó Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector pBT lac-operon hoạt động bình thường, không có đoạn gen lạ nào xen vào, khi có chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzim β - galactosidase, enzym này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận được plasmit mang lac operon không hoạt động. Chính vì vậy, khi có chất cảm ứng IPTG thì gen
38
không tổng hợp enzym β -galactosidase và không xảy ra sự chuyển hoá X-gal. Lac operon bị bất hoạt là do đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa promoter của operon gen lacZ. Chính vì vậy lac operon không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên không có sự dịch mã thành enzym được.
Để kiểm tra xem các dòng khuẩn lạc trắng này có mang gen quan tâm không, chúng tôi tiến hành phản ứng conoly PCR với cặp mồi pUC18. Kết quả được thể hiện trên hình 3.7.
5 4 3 2 1 M
750 bp
500 bp
Hình 3.7. Kết quả conoly PCR từ các dòng khuẩn lạc trắng (M: marker; 1-2: dòng khuẩn lạc của mẫu R3.13; 3-5: dòng khuẩn lạc của mẫu R3.44)
Vì pUC là mồi thiết kế chung cho các vector tách dòng nên khi kiểm tra sản phẩm colony-PCR vừa dòng hoá thì kích thước của sản phẩm sẽ cao hơn đoạn gen mã hóa osDREB1F. Kết quả kiểm tra cho thấy kích thước của gen quan tâm sẽ ở vị trí tăng 180 bp so với khi PCR với mồi pUC18. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy ở giếng từ 1 đến 3 đều xuất hiện các vạch ở vị trí khoảng 750 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước của gen quan tâm khi PCR với mồi pUC18. Có thể kết luận ban đầu rằng các dòng khuẩn lạc tương ứng đều mang gen quan tâm. Các dòng mang plasmid có gen osDREB1F được nhân lên để tách plasmid.
39
7.4.4.4.Tách DNA plasmid tái tổ hợp
Nuôi khuẩn lạc trắng đã chọn bằng colony-PCR mang gen osDREB1F trong 3ml môi trường LB lỏng rồi tách phục vụ cho việc xác định trình tự. Tế bào được thu bằng cách ly tâm, rồi hoà tan trong TELT, lysozym được bổ sung nhằm phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Bổ sung izopropanol làm kết tủa DNA, protein. Làm sạch DNA bằng cồn 80%. Sau đó ủ với Ribonuclease trong 2 giờ để loại hết RNA. Cuối cùng, plasmit tiếp tục được tinh sạch để đọc trình tự nucleotit. Plasmit tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agrarose 0,8%.
M 1 2
4500 bp 2500 bp
Hình 3.8. Kết quả tách chiết plasmid của các dòng khuẩn mang vector tái tổ hợp M: marker; 1, 2: plasmid mang gen tương ứng của các mẫu R2.13, R2.44
Kết quả tách chiết plasmid trên hình 3.8 cho thấy, các mẫu DNA plasmit tinh sạch đạt kết quả tốt, đều có các băng vạch rõ nét và gọn chứng tỏ plasmid không bị đứt gẫy và có hàm lượng lớn đủ điều kiện cho bước giải trình tự.
Để khẳng định lại các plasmit cần tìm có gắn đoạn gen sản phẩm PCR hay không, chúng tôi đã chọn DNA plasmit đã tinh sạch của mẫu thí nghiệm để tiến hành cắt bằng enzym giới hạn BamHI ở 37oC trong 2 giờ. Vị trí của enzym này trong vector là nằm ở hai đầu đoạn gắn. Vì trong trình tự của gen osDREB1F ở dữ liệu trên NCBI có một điểm cắt của enzym giới hạn ở vị trí khoảng 430 bp. Kết quả cắt được thể hiện trên hình 3.9.
40
M 1 2
2500 bp
430 bp
Hình 3.9. Kết quả cắt plasmid của các dòng khuẩn mang vector tái tổ hợp M: marker; 1, 2: plasmid mang gen tương ứng của các mẫu R2.13, R2.44
Trên hình 3.10 cho thấy cả 2 giếng đều có 2 băng trong đó băng trên có kích thước khoảng 2500 bp là plasmid pBT và băng dưới là gen osDREB ở vị trí đúng như tính toán lý thuyết là xấp xỉ 430 bp. Như vậy có thể lấy plasmid đem đi đọc trình tự.